DB33-T 2269-2020猪圆环病毒 2 型与 3 型双重荧光定量 PCR检测方法

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DB33浙 江 省 地 方 标 准DB33/T2269—202023PCR检测方法DuplexfluorescencequantitativePCRmethodforthedetectionofporcinecircovirustype2andtype32020-06-30发布 2020-07-30实施浙江省市场监督管理局 发布DB33/T2269DB33/T2269—2020II前 言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。PAGEPAGE5猪圆环病毒2型与3型双重荧光定量PCR检测方法范围本标准规定了猪圆环病毒2型与3型双重荧光定量PCR的检测方法。本标准适用于猪圆环病毒2型与3型的核酸检测。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct（Cyclethreshold）DNA（DeoxyribonucleicAcid）PBS（PhosphateBufferSolution）PCR（PolymeraseChainReaction）PCV-2型（PorcineCircovirus2）PCV-3型（PorcineCircovirus3）Taq：TaqDNA（TaqDNApolymerase）除非另有说明，所用试剂均为分析纯；灭菌水，0.01mol/LPBS和8mmol/LNaOH配制中所使用的水应符合GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法中一级水的要求。DNAzolReagent：DNA2～8475-208mmol/LNaOH。0.01mol/LPBS，pH7.2。2×PremixHSTaq（PCRbuffer，HSTaq，dNTPs，Mg2+，RNaseH）。23PCV-3（ORF2）序列见附录A。用于荧光定量PCR10µmol/L，Taqman5µmol/L——PCV-2-F：5’-TCACCTATGACCCCTATG-3’；——PCV-2-R：5’-GGAAGTAATCAATAGTGGAATC-3’；——PCV-2-P：5’-FAM-ACTCCTCTCGCCATACCATAACC-BHQ1-3’；——PCV-3-F：5’-TGGCTCAACACATATGAC-3’；——PCV-3-R：5’-ACGGACTTGTAACGAATC-3’；——PCV-3-P：5’-HEX-TGCCGTAGAAGTCTGTCATTCCA-BHQ1-3’。1.5mL15mLPCR412000r/min（-80℃）。PCR研钵。采样及样品前处理过程中应注意无菌操作，防止样本交叉污染。药匙、剪刀、镊子，经160℃干热灭菌2h。15mL1：40.01mol/LPBS343000r/min20min1.5mL血清样品无需处理，直接用于核酸提取。6h～8h2～82480冻次。应在核酸提取区进行。DNAzoln1.5mLn22500µLDNAzol250µL，105min4℃，10000r/min10min。900µL1.5mL1mLDNAzol500µL5～81min～3min4℃，5000r/min5min。1mL753～60.5min～1min；4000r/min2min（。50µL8mmol/LNaOH20可采用核酸提取试剂盒或自动化核酸抽提仪及配套核酸抽提试剂进行核酸抽提。PCR实时荧光PCRPCRn，其中n221表1 每个品应系制表体系组分用量2×PremixHSTaq10µLPCV-2-F0.4µLPCV-2-R0.4µLPCV-2-P0.8µLPCV-3-F0.4µLPCV-3-R0.4µLPCV-3-P0.8µLDEPC水4.8µL总量18µL加样PCR8.2.52µLDNA3000r/min30s实时荧光PCR9.2PCRPCR9530s；955s；6030s，4060PCV-2ReportDyeDyeReportDyeDyeBHQ。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阳性对照品“S”型曲线指数扩增初期的荧光值为准。FAMHEXCtSFAMHEXCtFAMCt≤36.0“S”PCV-2FAMCtPCV-2FAMCt值＞36.0“S”Ct≤38.0PCV-2PCV-2HEXCt≤36.0“S”PCV-3HEXCtPCV-3HEXCt值＞36.0“S”Ct≤38.0PCV-3PCV-3附 录 A（规范性附录）配制方法8mmol/LNaOH称量0.32gNaOH，溶解到1000mL二级水中，混匀，分装，常温保存。0.01mol/LPBS（pH7.2）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O)3.0g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g，氯化钾（KCl）0.2g，氯（NaCl)810003mol/L的NaOH调pH12115minPCV-3（ORF2）序列ATGAGACACAGAGCTATATTCAGAAGAAGACCCCGCCCAAGGAGACGACGACGCCACAGAAGGCGCTATGCCAGAAGAAGACTATTCATTAGGAGGCCCACAGCTGGCACATACTACACAAAGAAATACTCCACCATGAACGTCATTTCCGTTGGAACTCCTCAGAATAATAAGCCCTGGCACGCCAACCACTTCATTACCCGCCTAAACGAGTGGGAAACTGCAATTAGCTTTGAATATTATAAGATACTAAAGATGAAAGTTACACTAAGCCCTGTAATTTCTCCAGCTCAGCAAACAAAAACTATGTTCGGGCACACAGCCATAGATCTAGACGGCGCCTGGACCACAAACACTTGGCTCCAAGACGACCCTTATGCGGAAAGTTCCACTCGTAAAGTTATGACTTCTAAAAAAAAACACAGCCGTTACTTCACCCCGAAACCAATTCTGGCGGGAACTACCAGCGCTCACCCAGGACAAAGCCTCTTCTTTTTCTCCAGACCCAC