产油真菌的诱变育种

产油真菌的诱变育种邵征超(浙江海洋学院数理海科系，浙江舟山316000)摘要介绍了产油真菌的产油机理，设计了产油真菌的诱变育种方法。关键词产油真菌诱变育种微生物油脂MUTATIONBREEDINGOFFUNGIPRODUCINGOILSHAOzhengchao(ZhejiangOceanUniversity,ZhejiangZhoushan316000)ABSTRACTthispaperaimstointroducemechanismofproducingoilsfrommicroorganism,establishasimpleandpracticalmethodforscreeningfungiproducingoil.KEYWORDSfungiproducingoil;mutationbreeding;microbialoils1前言随着石油资源的日益紧缺、石油价格的不断上涨、油品供需矛盾的日渐显现及环境污染问题的更加突出，多渠道开发可再生油脂资源成为必然。柴油是重要的油品.生物柴油具有能量密度高、含硫量低、燃烧充分、润滑性好等优良性能，还具有可再生、易生物降解、储运安全、抗爆性能好等特点，可作为优质的石化柴油代用品［1］。目前，国外用于生产生物柴油的原料主要是植物油，但原料成本占到总成本的70%〜85%［2］,经济可行性差。产油微生物具有资源丰富、油脂含量高、碳源利用谱广等特点，开发潜力大，所以微生物油脂具有良好的发展前景，可能在未来生物柴油产业中发挥重要的作用。在适宜条件下.某些微生物产生并储存的油脂占其生物总量的20%以上，具有这样表型的菌株称为产油微生物［3］。已知细菌、酵母、霉菌、藻类中都有能产生油脂的菌株.但以酵母菌和霉菌为主。微生物油脂(fMicrobialoils)又称为单细胞油脂(Singlecelloil，SCO1)，是由微生物在一定的条件下，利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源，在菌体内产生的大量油脂［4］。2微生物残油脂机理微生物产油脂的过程，本质上与动植物产生油脂的过程相似，都是从乙酰CoA羧化酶的羧化催化反应开始，经过多次链的延长，或再经去饱和酶的一系列去饱和作用等，完成整个生化过程［5］。其中去饱和酶是微生物通过氧化去饱和途径、生成不饱和脂肪酸的关键酶，该过程称之为脂肪酸氧化循环。微生物利用葡萄糖经糖酵解或磷酸己糖等一系列途径合成乙酰CoA［8］。乙酰CoA羧化酶催化脂肪酸合成的第一步，是第一个限速酶。去饱和酶的生物学功能是保证生物膜的正常功能，即提供生物膜必须的流动性和基本的脂双层结构。在酵母和霉菌中存在的去饱和酶主要是酰基辅酶A去饱和酶(acyl.CoAdesaturase)(Macherel，1995)，它可将双键引入到CoA结合的脂肪酸中。铁离子参加了去饱和酶催化中心的构成(咸漠，2000)，脂肪酸去饱和酶在脂肪酰链的特殊位置引入双键，目前己发现在酵母和霉菌中存在A9、A12、A6、A15、A5位的去饱和酶，这些酶大多存在于细胞的微粒体上［9］。许多因素可影响去饱和酶的活性，如温度、pH、离子、小分子有机物等。这些因素的改变可以影响脂肪酸的组成、含量、不饱和度等［10］。3影响微生物油脂合成的菌种因素不同的微生物.其产生油脂的含量及油脂肪酸组成均不相同。细菌、霉菌和酵母、藻类均能产油脂，其中以霉菌和酵母为主。表1[11]、表2[11]列举了几种微生物的产油脂情况。表1不同菌种在同样培养条件下的油脂含量菌种菌丝体干质it/g油脂质it/g含油量.％黑曲霉5.5290.21813.94米曲霉1.24860.1512.01少根根霉2.6690.715226.5红酵母0.5060.30657.73酿酒酵母1.2320.39532.06表2不同菌种的脂肪酸组成酿酒酵母脂肪酸黑曲霉米曲霉少根根霉红酵母C14:00.51.60.20.31C15：00.50.50.71Cl6：019.323.31810.47.6Cl6：l1.6850.14C17:04.23.21.94Cl8：06.98.36.610.843.08Cl8：l40.728.731.652.2529.84C18:231.630.832.842.941.944试验材料与方法入4.1实验材料A4.1.1菌株A本实验室分离并保存。FR3,刺抱小克银汉霉（Cunninghamellaechinulata）；AAGEDm59、AGEDm95为菌株AGED激光诱变A株，多形单毛抱（MonoblepharispolymorphaComu）。A其中FR37-〜][麻酸含量、AGEDm59花生四稀酸含A量、AGEDm95二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸含量A较高。A4.1.2实验仪器A超净工作台、格兰氏微波炉、索氏抽提器、粉碎机、电子天平；A气相色谱仪：福立9790气相色谱仪，CT-IA氮、A氢、空气发生器（武汉科林分析技术研究所），GPI一2A气体净化器（福立仪器）。A4.1.3试验试剂A乙醚、石油醚、苯、甲醇、氢氧化钾；AGLA甲脂、AA甲脂、EPA甲脂及DHA甲脂标准A品购白Sigma公司，其他试剂均为分析纯。4.1.4培养基A斜面培养基为PDA培养基；种子和发酵培养基A为PDY液体培养基。4.2试验方法a4.2.1抱子悬液的制备AFR3取7天种龄、AGEDm59、AGEDm95取l0A天种龄的斜面菌株，用无菌水洗下抱子（并用接种针轻A刮表面），FR3配成10一、AGEDm59、AGEDm95配A成l0。浓度的抱子液。4.2.2诱变及保种A紫外诱变：先打开紫外灯照射30min,取0.5ml抱A子悬液到倒好DPA固体培养基的平皿中，涂布均匀，A放在紫外灯下（紫外灯为25W，照射距离为35cm）A照射，之后置于25°C避光24h培养。随机挑取单菌落A于斜面中保存。微波诱变［12］：由于微波照射会产生热效应，因此在进A行微波诱变时采用了间歇性照射，即先照射一段时A间后进行冷却，再照射，照射时间为各次照射时间的A累加。250mi三角瓶装100ml经过活化的抱子悬液（即A先在150r/min的摇床上振荡5h），用中等强度功率A照射，每次照射的时间为10秒，随机挑取的诱变株都A保存于斜面中。4.2.3菌丝培养和收获A把长好的诱变株从斜面转到500ml三角瓶中（内A装200m1PDY液体培养基），置于25C中150转/分钟A摇床上培养。FR3培养4天，AGEDm59、AGEDm95A培养6天后下样，用滤布过滤获得湿菌丝体［13］。将所得A湿菌丝体在36C烘箱内烘干，称重，计算生物量。4.2.4油脂提取及甲脂化A将干菌体粉碎，并用脱脂滤纸包好，用100ml乙A醚在43〜C进行索氏提取6h，回收溶剂，用N2吹走残A留溶剂称重，计算粗油脂量。4.2.5气相色谱分析条件A色谱柱：FFAP交联石英毛细管柱（0.25mmx0.25Apmx30m）；检测器：氢火焰检测器（FID）；载气：N2（流量60mLlmin）：温度：进样器温度160C，检测器温A度240C；柱温：160C升至200C（8C/rnin），继续升A至220C（2C/min），恒温7min，降至160C。4.2.6多不饱和脂肪酸含量分析A用微量进样器吸取l上层清液进样分析，对照A标准品保留时间进行定性，由面积归一化法确定相对A百分含量。5产油真菌展望产油微生物除可代替动植物油脂生产食用油脂.特别是保健类功能性油脂外，还可以作为生产生物柴油的油源。生物柴油由各种动、植物油脂经酯化或转酯化工艺而得，而大部分微生物油的脂肪酸组成和一般植物油相近，以C和C系脂肪酸，如油酸、棕榈酸、亚油酸和硬脂酸为主，因此微生物油脂可替代植物油脂生产生物柴油。由于技术经济原因.过去单细胞油脂很少有规模化生产的报道。但随着工业生物技术的发展，微生物油脂发酵从原料到过程都在不断取得新的进展。最近美国国家可再生能源实验室（NREL1的报告特别指出，微生物油脂发酵可能是生物柴油产业和生物经济的重要研究方向［14］。当前生物柴油的研究已是世界科研的焦点.世界各国纷纷根据本国国情选择合适的油脂原料生产生物柴油.大多采用植物油脂制取生物柴油。植物油脂因生长周期长、占地面积大，不符合我国国情.因此油脂原料供给问题是我国生物柴油产业发展的关键。产油微生物具有资源丰富、油脂含量高、生长周期短、碳源利用谱广、不受气候限制等特点［15］，易于实现大规模生产。加快微生物油脂发酵技术创新和产业化进程.可为我国未来生物柴油产业化和油脂化工行业的健康发展提供保障。现代生物技术的发展使产油微生物的研究技术在不断趋向成熟。微生物用于油脂工业已成为现实.但随着能源危机和环境保护问题的突出，其开发研究方向主要为：继续寻找或改良高产油脂菌种；降低产油微生物培养成本，如利用廉价碳源等，促进微生物油脂产业化；对微生物发酵产油脂工艺进行优化；微生物油脂替代植物油脂制取生物柴油，降低生物柴油制取成本。目前国际上对产油微生物甘油三酯生物合成和代谢调控机制的研究已取得重要进展，如能通过基因工程和原生质体融合，对现有菌种进行改造，是获得高产油脂菌株的一条好途径。另外，深入研究微生物在产油脂时，碳源、氮源、碳氮比、温度、pH值等因素对其的影响，有利于改进发酵工艺，进一步降低发酵成本，最大限度地发挥菌种产油脂的能力再者.需要继续研究微生物油脂的提取纯化技术.为微生物油脂大规模工业化生产打下基础[7]。因此，产油微生物的研究，特别是利用产油微生物生产油脂为生物柴油提供原料油脂方面的研究.对解决当今世界各国油脂原料供应问题、促进生物柴油的推广使用、解决环境问题和人类能源问题等都具有重要的意义。参考文献TechnicalReport，NRER/TP一'580一24443，1998KSTyson.Biodieselresearchpmgress1992一1997.NRELJVGerpen.Businessmanagementforbiodieselproducers.NRELTechnicalReport，NREL/SR一'51036342，2004CRatledge.JPWynnThebiochemistryandmolecularbiologyoflipidaccumulationinokaginousMic^ganisEs.AdvApplMicrobio1.2002.5l：l〜5l4颜治.陈晶微生物油脂及其开发利用研究进展.粮食与油脂，2003(7):l3〜l55薛飞燕.张栩等.微生物油脂的研究进展及展望生物加工过程，2005，3(1):23-276刘波，孙艳，刘永红等.产油微生物油脂生物合成与代谢调控研究进展[J].微生物学报，2005，45(1)：153-1567易绍金，教授，产油微生物的研究及其应用，中外能源，2006年4月，第11卷第2期8施安辉.谷劲松等.高产油脂酵母菌株的选育、发酵条件的优化及油脂成分分析.中国酿造，1997(4)：10〜l9杨建斌，油脂化工/生物柴油专家，生物油脂10董欣荣，曹健，微生物功能性油脂的研究，郑州粮食学院学报.1999，20(4):10~111李小松，俞扬帆.微生物油脂.食品科技.1997(5):8〜912李永泉《微波学报》2001第1期-万方数据13周而勋杨媚李琳曾伟达《华南农业