儿童紫癜性肾炎血管紧张素原基因多态性分析

儿童紫癜性肾炎血管紧张素原基因多态性分析〔〕:

摘要：目的讨论焦磷酸测序技术对MUTYH、PIK3C2B、ALDH1L1、TLR1、MAML3、PLG、P、AGT基因的12个位点的基因多态性与儿童紫癜性肾炎的相关性。方法由49例HSPN患儿及21例安康儿童组成，通过外周静脉血提取DNA，经PCR扩增后，通过焦磷酸测序法〔Pyrosequencing法〕对MUTYH、PIK3C2B、ALDH1L1、TLR1、MAML3、PLG、P、AGT基因进展单核苷酸多态性检测。结果HSPN患儿与安康儿童在AGT基因rs699位点CC基因型具有统计学意义〔2=4.36，P=0.037，P

本研究选取了位于MUTYH、PIK3C2B、ALDH1L1、TLR1、MAML3、PLG、P、AGT基因的12个位点进展单核苷酸多态性检测，填补了儿童HSPN在基因研究领域的局部空白。

1资料和方法

1.1样本来源

病例组49例患儿均来源于近年在辽宁中医药大学附属医院门诊就诊患儿，男27人，女22人；平均〔9.552.89〕岁。安康儿童，男14人，女7人；平均〔9.192.56〕岁；HSPN的诊断根据儿童常见肾脏疾病诊治循证指南〔二〕，紫癜性肾炎的诊治循证指南〔试行〕[12]。

1.2试剂与仪器

1.2.1试剂

DNA提取试剂盒：柱式血液基因组DNA抽提试剂盒〔生工生物工程〔上海〕股份〕，PCR：SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒，〔生工生物工程〔上海〕股份〕，测序BigDyeTerminatorv1.1、POP-7trade;Polymer、HiDiFormamide，ThermoFisher〔AppliedBiosystemstrade;〕。

1.2.2仪器

PCR仪、测序仪〔美国ABI〕，凝胶成像仪〔上海复日科技〕，电泳仪〔北京六一仪器厂〕，冰箱〔青岛海尔股份〕。

1.3方法

1.3.1DNA提取

患儿禁食12h后于清晨空腹抽取外周静脉血2mL，搜集于EDTA采血管中，于5分钟内分装同时置于-80℃冰箱内冷冻保存，用于提取DNA。

1.3.2由生工生物工程〔上海〕股份应用引物设计软件Premier5软件对rs35352891、rs17847749、rs140551047、rs778022672、rs202212492、rs534986978、rs570805279、rs4252128、rs747448179、rs4762、rs699、rs566112479位点完成引物设计。

1.3.3PCR反响体系

每个扩增反响体系为50L，10xTaqBuffer〔withMgCl2〕5L，dNTP〔10mM〕2L，上下游引物各2L，Taq酶0.5L，ddH2O，50L，模板DNA1~2L。反响条件：95℃〔5min〕，35x〔94℃30sec，55℃25sec，72℃50sec〕，72℃5min。

1.3.4测序

1.3.4.1PCR产物纯化及条带切胶回收

①准备工作，检查WashSolution中是否已参加乙醇；检查BufferB3中是否已参加异丙醇；检查BufferB3是否出现沉淀。

②在PCR反响液中参加5倍体积的BufferB3，充分混匀。③8000xg离心30秒。倒掉搜集管中液体。④参加500LWashSolution.9000xg离心30秒，倒掉搜集管中液体。⑤重复步骤4一次。⑥空柱于9000xg离心1分钟。将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央参加15~40LElutionBuffer，室温静置1分钟后，离心1分钟，保存管中DNA溶液。

1.3.4.2PCR产物的测序PCR反响，标准反响体系为20L，纯化的PCR产物1L，BigDye4L，BigDyeSeqBuffer2L，测序引物1L，灭菌去离子水12L。反响条件：96℃〔1min〕，25x〔96℃10sec，50℃5sec，60℃4min〕4℃。

1.3.4.3测序产物纯化

〔1〕每96孔依次参加2L125mMEDTA和2L3MNaAc到溶液中，再参加50L100%酒精，盖好，震荡4次，室温15min。

〔2〕板式离心机3000xg4℃离心30min；马上倒置96孔板，离心至185xg立即关闭离心机电源，停顿离心。

〔3〕加70L70%酒精，3000xg4℃离心15min；马上倒置96孔板，离心至185xg关闭离心机电源。此步可以重复1次。

〔4〕让酒精在室温挥发干净，参加10LHi-DiFormamide溶解DNA。

〔5〕在PCR仪上变性：95℃4min，4℃4min由生工生物工程〔上海〕股份采用sequenceanalysis软件对测序结果进展基因型分析。

1.4统计学分析

应用SPSS23.0forwindows软件对年龄、性别等一般特征资料进展数据分析，所有符合正态分布或近似正态分布计量资料采用〔s〕表示，两组间采用t检验。采用拟合优度卡方检验进展HWE平衡分析，以非条件逻辑回归分析所得的比值比〔Oddsratios,OR〕及其95%的置信区间〔Confidenceinterval,95%CI〕表示。基因型及其等位基因频率，各组间采用2检验，以P0.05〕、PIK3C2B基因rs17847749位点〔P=1.000〕、ALDH1L1基因rs140551047位点〔P=1.000〕、TLR1基因rs202212492位点〔P=1.000〕、MAML3基因rs534986978位点〔P=0.549，P>0.05〕、PLG基因rs4252128、rs747448179位点〔P=1.000〕、AGT基因rs4762位点〔P=0.728，P>0.05〕。

2.3AGT基因rs699位点基因型结果见图1。

2.4AGT基因rs699位点统计结果

在49例HSPN患儿和21例安康组中，rs699位点基因CC型P=0.037，OR=3.046，95%CI=1.049-8.842，P0.05，无统计学意义，结果见表1。

3讨论

儿童紫癜性肾炎是一种多基因、发病因素复杂的儿童肾系疾病之一，其占儿童继发性肾小球疾病的78.9％。少数患者可出现严重的肾脏病理损害，1％至7％[13]的患儿开展为终末期肾病。目前无论是从肾组织穿刺、代谢组学、基因多态性等方面的研究均是为了明确其发病机制，同时探寻其有效的治疗方式，而通过对其进展遗传学研究可以寻找到更加灵敏的标志物及为患儿提供更加准确的靶向治疗。肾素-血管紧张素系统在控制血压和钠稳态方面具有强大的作用。这些行动通过肾脏，心血管系统和中枢神经系统的综合行动进展协调。除此之外，肾素-血管紧张素系统还影响从炎症到免疫反响等一系列的发病过程。其中肾素-血管紧张素系统〔RAS〕的激活在慢性肾病的发病机制中起关键作用[14]。越来越多的证据说明，各种组织中的局部RAS，包括脑[15]，心脏[16]，脉管系统[17]和肾脏[18]，均由系统性RAS独立调节。

血管紧张素II〔AngII〕是RAS中最强大的生物活性产物，肾脏AngII程度的异常升高可导致肾功能损害和肾组织损伤[14]。在肾脏中，AngII来源于其局部形成的基质血管紧张素原[19]〔AGT〕。实验研究已经说明，在肾组织AGT程度反映肾内RAS活性[14]。提醒了患者尿液中AGT程度的增加提示了慢性肾病的进展加重。因此，AGT在肾脏疾病的开展和进展中起重要作用。

国内外对于RAS基因多态性与HSP、HSPN的相关性研究说明，AGT基因多态性可以影响HSPN的发病[19]。本文就AGT基因rs699位点基因多态性与HSPN发病进展研究，即讨论HSPN患儿基因组中是否存在单个碱基上的变异，也就是单核苷酸多态性。

基因多态性又称遗传多态性，是精准医学分支之一，在一个生物群体中，会同时存在两种或多种不连续的基因型。主要包括DNA片段长度多态性、DNA重复序列多态性、单核苷酸多态性。本文研究的即是单核苷酸多态性，SNPs一般是有两种碱基构成，是一种二态的标记，有利于对其进展基因分型，可以对位点进展测序检测，或对未知位点进展筛查，其优势是可以快速、规模化筛查，对于临床应用更加具有优势。

因此笔者基于文献及NBCI的查找，基于前人对rs699位点的研究及目前尚未研究的位点进展了新一代测序，采用焦磷酸测序法[20〔]Pyrosequencing法〕。焦磷酸测序法是一种DNA测序方法，是一种理想遗传分析技术平台。是Sanger测序法的重要补充，与被普遍应用的限制性片段长度多态性聚合酶链反响〔PCR-RFLP〕技术相比具有灵敏度高、准确性高、准确性好等特点。同时焦磷酸测序极大的减少了认为影响因素，利于构建标准化的操作流程，做到最大的质量控制。

其中rs699是外显子2中的T至C取代，在密码子235〔M235T〕处产生功能性甲硫氨酸〔M〕至苏氨酸〔T〕交换，在高加索及亚洲成年人IgA肾病[21]过敏性紫癜、紫癜性肾炎[22]均具有相关性研究。本次研究的结果也显示HSPN病例组与安康对照组的分布具有明显的差异性。与正常儿童相比差异有统计学意义〔P=0.037〕纯合子CC型及其C等位基因频率显著高于正常儿童。

我们认为AGT基因rs699位点在HSPN发病、病情进展及判断预前方面可能起到一定作用。纯合子CC型的携带可能是该病的一种重要的危险因素，总的来说我们的结果可以局部地说明其是HSPN遗传因素之一。

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