第二节胚胎工程实验技术(北师大)

小资料：牛刚出生时，每侧卵巢大约含有15万个卵泡，每个卵泡内都有一个初级卵母细胞。出生后能够发育成成熟排卵的卵泡只有200个左右，一生产下牛犊4~5头。其他哺乳动物的情况类似。可见：哺乳动物一生中卵母细胞的有效利用率

，胚胎工程要研究解决这样的问题。很低

指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术。包括体外受精、胚胎移植、胚胎分割移植、胚胎干细胞培养等技术。即各种胚胎操作技术。研究对象：胚胎工程：主要是高等脊椎动物，尤其是哺乳动物研究水平：细胞水平定义：操作对象：早期胚胎或配子第2节胚胎工程实验技术一、人工授精和胚胎体外培养（一）人工授精：1、精子的获取2、卵细胞的获取3、体外授精（一）人工授精：1、精子的获取：①可采集部位：睾丸、附睾、射出的精子及雌性生殖道内。②方法：常用人工采集的方式采集精液。③精液的保存：低温保存（一）人工授精：2、卵细胞的获取：①可采集部位：卵巢、输卵管、子宫卵母细胞②方法：手术法：非手术法：中小型动物，如鼠、兔、羊大型动物，如牛超数排卵冲洗输卵管采卵子宫冲卵超排卵技术利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，这个过程就称为超数排卵。超数排卵定义：指人为注射外源性促性腺激素，促使卵巢排出更多成熟卵细胞。下丘脑促性腺激素释放激素垂体促性腺激素卵巢排卵卵细胞发生的激素调节垂体促卵泡刺激素（FSH）促黄体生成激素（LH）促进卵泡细胞生长发育促进卵泡细胞释放更多雌激素促进卵泡生长下丘脑促性腺激素释放激素释放卵细胞卵巢（一）人工授精：3、体外授精：获取的卵细胞培养液MⅡ中卵母细胞获取的精液精子精浆离心分离精子获能培养获能的精子培养液法显微注射法受精卵一、人工授精和胚胎体外培养（二）体外培养受精卵发育培养液由于不同时期的胚胎生理代谢不同，故需配置一系列含有不同成分的培养液（CO2、O2、AA、核苷酸、无机盐、能源物质、维生素、激素、动物血清等。）早期胚胎冷冻保存植入受体胚胎体外培养是胚胎工程的核心技术，但是由于哺乳动物胚胎发育条件异常复杂，因此，只能培养不同阶段的胚胎，目前还无从受精卵培养到新生儿的全体外培养。指将雌性动物体内的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式获得的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。二、胚胎移植技术1、定义：1、定义：良种雌性动物体内的早期胚胎体外授精或其他方式获得的胚胎（超数排卵获得多个胚胎）植入其他雌性动物供体发育个体受体二、胚胎移植技术条件：生产价值高、性状优良条件：同种、同期发情、健康胚胎来源胚胎的来源：雌性动物的早期胚胎或体外受精及其他方式得到的胚胎。供体：提供胚胎的个体。受体：接受胚胎的个体。受体的条件：同种、生理状态相同。培养体内授精超数排卵2、胚胎的来源：二、胚胎移植技术体外授精供体多个卵细胞多个早期胚胎取出手术法非手术法多个受精卵早期胚胎3、胚胎植入：二、胚胎移植技术手术法：非手术法：取出输卵管和子宫，注入胚胎通过一定的器械，注入胚胎（7）胚胎的移植方法一：手术法具体做法：引出受体子宫和卵巢，将胚胎注入子宫角，缝合创口。方法二：非手术法将装有胚胎的移植管送入受体母牛子宫的相应部位，注入胚胎。4、基本程序：以牛为例供体母牛良种公牛受体母牛同期发情处理超数排卵精子受精卵早期胚胎收集胚胎冲胚发育检测健康胚胎胚胎移植保存手术法非手术法分娩胚胎移植后代体内授精多个卵细胞良种母牛卵母细胞的体外培养良种公牛精子体外获能体外受精良种牛体外受精胚胎胚胎移植受体牛良种犊牛成熟期牛屠宰加工厂市场采集卵巢中的卵母细胞“试管牛”工厂化生产的技术流程图超数排卵有性生殖

试管动物与克隆动物相比生殖方式：技术手段：有性生殖核移植技术、胚胎移植体外受精胚胎移植无性生殖5、胚胎移植的现状和意义1)保持供体优良特性(加速育种工作和品种改良)2)节约成本\费用(大量节省购买种畜的费用)；3)大规模繁殖(一胎多产)；4)

保存品种资源和保护濒危物种；5)充分发挥雌性个体的繁殖潜力,缩短供体本身的繁殖周期。三、胚胎分割优势:可成倍增加胚胎数量，可以快速繁殖良种畜。概念:将早期胚胎切割成2等份，4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。一）胚胎分割技术研究概况

胚胎分割技术开始于Nicholas（1942）对大鼠2-细胞卵裂球的分离和培养。其后，Tarkowski等研究了小鼠1/4,2/4,3/4卵裂球的发展规律,得到了世界上首例半胚来源的活体动物。20世纪70年代以来,随着胚胎培养及移植技术的发展和提高,哺乳动物胚胎分割技术取得了突破性进展。目前胚胎分割的研究方向也正向着简单化和实用化发展。我国1986年张涌等首次利用胚胎分割方法获得同卵双生小鼠，1987年又获得同卵双生山羊。1986年窦忠英等获得分割胚牛犊，1990年又获得奶牛四分胚后代。1987年谭丽玲等获得同卵双生犊。特点：

后代具有相同的遗传物质，克隆选择的胚胎：发育良好的，形态正常的桑椹胚或囊胚使用的主要仪器：

体视显微镜、显微操作仪、切割刀、切割针注意:将内细胞团均等分裂二）胚胎分割的基本程序切割器具的准备；胚胎的预处理；胚胎的分割；分割胚的培养；分割胚的移植；1.切割器具体视显微镜；显微操作仪；胚胎固定管；胚胎分割针；2.胚胎的预处理用链霉蛋白酶处理链霉蛋白酶的作用：使透明带软化、变薄或去除3.胚胎的分割方法酶解法：用链霉蛋白酶处理机械法：用分割针切开透明带胚胎分割的基本操作选择良好的桑椹胚或囊胚移入培养皿中，用分割针或分割刀片将其切开，吸出其中的半个胚胎注入透明带中或直接移植给受体。4.分割胚的培养；

原因：早期胚胎切割后发育能力低，一般是经包埋后移植到中间受体的输卵管中培养几天至囊胚，再从输卵管中回收胚胎，最后移植给受体。方法：体外培养体内培养（需琼脂包埋）琼脂包埋的作用固定胚胎便于回收分割胚的移植要求：胚胎分割后可以直接移植给受体，也可以进行超低温冷冻保存。为提高冷冻胚胎移植后的受胎率，分割的胚胎需要在体内或体外培养到桑椹或囊胚阶段，再进行冷冻。受精卵分裂

早期胚胎胚胎分割基本过程代孕母牛植入植入分割胚胎分割的基本过程胚胎移入培养液分割胚胎（机械法、酶处理）移植胚胎给受体着床产仔三）胚胎分割技术的应用应用：在畜牧方面：扩大优良家畜的数量在研究方面：培养遗传特性相同的实验动物性别鉴定存在问题：如：早期胚胎细胞的分化和定位的发育机制不同阶段胚胎细胞的分化时间和发育潜力四、胚胎干细胞核移植技术1.概念：（胚胎干细胞）：简称ES或EK细胞，是由早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞。2.特点:1)形态：体积小、细胞核大、核仁明显。2)功能：具有发育的全能性；是一种高度未分化的细胞，可分化为成年动物体内任何一种组织和器官。3）应用：在体外培养的条件下，可以增殖而不发生分化；对它可以进行冷冻保存，也可以进行遗传改造。3.主要用途：(1)治疗人类的某些顽症(2)培育出人造组织器官，用于器官移植(3)是研究体外细胞分化的理想材料1.饲养层细胞培养体系的建立饲养层培养体系的构成胚胎成纤维细胞作用：抑制细胞分化成纤维细胞（fibroblast）：是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymalcell)分化而来。细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，细胞核卵圆形，核仁大而明显。细胞功能活动旺盛，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动。成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。饲养层细胞（feederlayer）：在正常机体内，细胞除了获得一些血液来的营养外，还在细胞与细胞之间互换特殊的物质，用于分裂分化和营养等。因而，在细胞体外培养中，除了正常的培养基外，先培养一层特殊的细胞，然后再在其上接种要实验的细胞，这样更能模拟体内环境。这些特殊的细胞就是饲养层细胞，通常是成纤维类细胞，这些细胞可以提供实验细胞更好的营养，有的分化研究则是必须有饲养层细胞。

2.胚胎干细胞的获得时期：囊胚或囊胚期以前如小鼠：桑椹胚、囊胚人体：囊胚、原始生殖细胞培养：置于含饲养层的培养液中培养方法：原代培养和传代培养传代培养的作用：抑制胚胎干细胞分化一）胚胎干细胞核移植程序饲养层细胞培养体系的建立胚胎干细胞的获得胚胎干细胞的核移植胚胎干细胞培养3.胚胎干细胞的核移植指把胚胎干细胞核移植到去核的卵细胞中，经过胚激活、胚胎培养、胚胎移植后直接由受体完成克隆动物的技术。胚胎干细胞核移植：

二）胚胎干细胞的应用培养克隆动物的核供体获得基因敲除动物治疗性克隆1.下列有关动物胚胎移植的叙述中，错误的是A.受孕母畜体内的受精卵或胚胎均能移植B.受体母畜必须处于与供体母畜同步发情的状态C.超数排卵技术要使用一定的激素D.试管婴儿只是受精及早期卵裂过程在试管中进行2.下列对于优良种畜的胚胎移植的说法不正确的是A.供体母牛必须是同一物种的良种B.受体母牛必须是同一物种的良种