酪氨酸酶的提取及其催化活性研究

酪氨酸特性及其影响因素摘要：酶是由生物细胞合成的、对特定底物起高效催化作用的蛋白质，是生物催化剂。生物体内所有的化学反应几乎都是在酶的催化作用下进行的。只要有生命活动的地方就有酶的作用，生命不能离开酶的存在。在酶的催化下，机体内物质的新陈代谢有条不紊地进行着；同时又在许多因素的影响下，酶对代谢发挥着巧妙的调节作用。生物体的许多疾病与酶的异常密切相关；许多药物也可通过对酶的作用来达到治疗的目的。随着酶学研究的深入，必将对人类社会产生深远影响和做出巨大贡献。Summary:Theenzymeishighefficiencycatalystonaspecificsubstrateproteinsynthesisbybiologicalcellsisthebiologicalcatalyst.Chemicalreactionsinallorganismsisalmostintheunderthecatalysisofenzyme.Aslongasthereislifethereisthefunctionofenzymetheenzymeinthepresenceoflifecannotleave.Intheenzymecatalyticmachinebodymaterialthenewsupersedestheold.Witheverythingingoodorderandwellarranged;andatthesametime,theinfluenceofmanyfactorsundertheregulationofenzymeplayscleverlyonmetabolism.Manydiseasesandenzymeoforganismsarecloselyrelated;manydrugscanalsobebasedontheroleoftheenzymetoachievethepurposeoftreatment.Withthein-depthstudyofboundenzymehaveafar-reachingimpactonhumansocietyandmakegreatcontributionsto.关键词：酶催化活性影响因素正文引言：酶是具有催化作用的蛋白质。其活性仅决定于它的蛋白质结构。酶与一般非生物催化剂相比，具有以下几个特点：酶的主要成分是蛋白质。它具有表现活性和专一性所必需的空间结构，以提供反应中心。由于蛋白质遇高温、强酸、强碱、重金属盐或紫外线等容易变性而失活，所以酶促反应都是在比较温和的条件下进行的。2、酶促反应所需的活化能较低。如使1mol蔗糖水解所需活化能高达1.34MJ，用H+离子作催化剂时活化能降至87.9KJ，若用蔗糖酶催化时只需39.4KJ。酶的催化效率非常高。酶的催化效率通常比非催化反应高108~1020倍，比一般非生物催化剂高107~1013倍。酶具有高度的专一性。酶对所作用的底物有严格的选择性，每一种酶只能对某一类物质甚至只对某一种物质起催化作用，这是一般非生物陈化剂所无法比拟的。影响酶作用的因素有酶的浓度、底物浓度、pH值、温度和抑制剂等。在酶浓度恒定的情况下，增加底物的浓度，可以提高酶促反应的初速度。当底物浓度增至某一限度后，反应初速度就不再随底物的浓度而变化，而是逐渐趋近某一极限值，这个极限值称为最大速度(Vmax)。酪氨酸的提取及其催化活性研究一、前言：生物酶的基本知识酶（enzyme）是由生物细胞合成的、对特定底物（substrate）起高效催化作用的蛋白质，是生物催化剂。生物体内所有的化学反应几乎都是在酶的催化作用下进行的。只要有生命活动的地方就有酶的作用，生命不能离开酶的存在。在酶的催化下，机体内物质的新陈代谢有条不紊地进行着；同时又在许多因素的影响下，酶对代谢发挥着巧妙的调节作用。生物体的许多疾病与酶的异常密切相关；许多药物也可通过对酶的作用来达到治疗的目的。随着酶学研究的深入，必将对人类社会产生深远影响和作出巨大贡献。酶与一般非生物催化剂相比，具有以下几个特点：1、酶的主要成分是蛋白质。它具有表现活性和专一性所必需的空间结构，以提供反应中心。由于蛋白质遇高温、强酸、强碱、重金属盐或紫外线等容易变性而失活，所以酶促反应都是在比较温和的条件下进行的，如人体中的各种酶促反应，一般都为37℃2、酶促反应所需的活化能较低。如使1mol蔗糖水解所需活化能高达1.34MJ，用H+离子作催化剂时活化能降至87.9KJ，若用蔗糖酶催化时只需39.4KJ。3、酶的催化效率非常高。酶的催化效率通常比非催化反应高108~1020倍，比一般非生物催化剂高107~1013倍。如存在于血液中能催化H2CO3分子分解的碳酸酐酶，它的催化效率非常高，每一分子每分钟可以催化数万个H2CO3分子分解。正是因为血液中有这样高效率的酶，才能及时完成排放CO2的任务，维持血液的正常生理pH值。4、酶具有高度的专一性。酶对所作用的底物有严格的选择性，每一种酶只能对某一类物质甚至只对某一种物质起催化作用，这是一般非生物陈化剂所无法比拟的。影响酶作用的因素有酶的浓度、底物浓度、pH值、温度和抑制剂等。在酶浓度恒定的情况下，增加底物的浓度，可以提高酶促反应的初速度。当底物浓度增至某一限度后，反应初速度就不再随底物的浓度而变化，而是逐渐趋近某一极限值，这个极限值称为最大速度(Vmax)。酶的以上特性已引起化学工作者的极大兴趣，例如酶正被作为分析试剂、探针得到应用；生物酶的化学模拟已广泛开展，将为研制高性能的工业催化剂奠定基础。酶的电化学研究的开展还开辟了生物电化学的新领域。酶化学是一门交叉学科，对其研究具有广阔的前景。酶促反应动力学是酶化学的主要内容之一，这方面的研究具有重要的理论和实践意义。二、实验目的1、认识生物体中酶的存在和催化作用，了解生物体系中酶促反应的特点与有机合成的不同和相同之处，认识一些生物化学过程的特殊性。2、掌握生物活性物质的提取和保存方法，学会使用仪器分析的手段研究催化反应，特别是生物化学体系中催化过程的基本思路和方法。三、实验原理酪氨酸是一种以Cu+或Cu2+为辅助因子的全酶，能催化空气中的氧对多巴的氧化反应。催化过程可以通过多巴转换反应过程的颜色变化来监测，通过测定吸光度随时间的变化来求的酶的活性。酪氨酸酶可用比色法测定。由于多巴转变成多巴红速率很快，在转到下一步产率慢得多，故可在酶存在下，测定多巴转变为多巴红的速率而测定酶的活性。（可用吸光度对时间作图，从所得的直线斜率求酶的活性）。酶参与的多巴转换反应如下：酪氨酸——多巴——多巴醌——无色——多巴红——二羟基吲哚——吲哚醌——黑色素酶的活性计算：一般pH、离子强度），25℃时在1min内转化1mol底物所需要的量为酶的活性单位。通过下式可计算出所用的酶的活性：，式中：a为所用溶液的酶的活性，为最大吸收处吸光度的变化，t为时间，k为酪氨酸的摩尔吸收系数，V为加入的酶体积。进而计算出所用原料中的酶的活性：，式中：为原料中酶的活性，为原料所得的酶溶液的总体积，m为原料总质量。本实验拟通过从土豆等物中提取酪氨酸酶并测定其活性，使我们对酶有个基本认识。当土豆、苹果、香蕉或蘑菇受损伤时，在空气作用下，很快变为棕色，这是因为它们的组织中都含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当内部物质暴露于空气中，在氧的参与下将发生反应，生成黑色素。四、仪器和试剂1、仪器：分光光度计、离心机、电子天平、研钵、水浴、容量瓶、秒表。2、试剂：酪氨酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠、盐酸、新鲜土豆。五、实验步骤及数据记录1、溶液配制1.1酪氨酸溶液的配制酪氨酸在中性水溶液中溶解度较小，因而配制过程中需加入一定量盐酸溶解。首先称取一定量的酪氨酸配制0.1mol/L酪氨酸储备液，在实验过程中稀释至0.02mol/L，使用时需要加入一定量的NaOH调节其pH接近中性。1.2缓冲溶液的配置首先分别配置0.2mol/LKH2PO4溶液0.2mol/LNaOH溶液，然后以一定的体积比配置pH=6.0和pH=7.2的KH2PO4-NaOH缓冲溶液。体积比如下表：表1.1KH2PO4-NaOH缓冲溶液的体积比pHKH2PO4与NaOH的体积比6.05∶0.5707.25∶3.5002、酶的提取取新鲜土豆，清洁后切碎，称取10.05g置于研钵中，加入7.5mLpH=7.2的磷酸缓冲溶液，用力挤压和研碎，用两层纱布滤出提取液，立即高心分离5min，倾出上层清液保存于冰箱中，提取液为棕色，在放置过程中不断变黑。3、酪氨酸最大吸收波长确定取2.5mL酶提取液用pH=7.2的缓冲溶液稀释至10mL比色管中，摇匀。取0.4mL已稀释过的土豆提取液，加2.6mLpH=6.0的缓冲溶液，加入2.0mL酪氨酸溶液，摇匀。反应约数分钟后，于分光光度计上扫描绘制酪氨酸的吸收光谱图。表1.2最大吸收波长的确定波长（nm）400410420430440450460470480490500吸光度0.4970.5090.5320.5600.5850.5900.5650.5500.5460.5500.551吸收光谱的绘制如下：图1.1酪氨酸吸收光谱的绘制由图1.1可知酪氨酸的最大吸收波长为450nm。4、酶活性测量分别取0.3、0.4、0.5mL稀释过的提取液于10mL比色管中，加入5.0mLpH=6.0的缓冲溶液，再加入4.0mL酪氨酸溶液，同时开始计时，用分光光度计在450nm处测定吸光度。开始6min内每分钟读一个数，以后隔2min读一个数，直至吸光度变化不大为止。以吸光度对时间作图，从直线斜率求出酶的活性。表1.3不同酶含量的活性测试酶稀释液体积时间（min）0.3mL0.4mL0.5mL10.4420.5870.61220.4410.5840.61130.4530.5910.63040.4560.5960.64150.4630.6120.65860.4710.6230.65380.4820.6240.662100.4750.6280.670120.4740.6310.668140.4750.6300.6695、酶活性因素测量（1）取1.5mL稀释过的提取液于10mL比色管中，加入4.5mLpH=6.0的缓冲溶液，再加入4mL酪氨酸溶液，分别加入一定量NaOH溶液和HCl溶液，然后用pH=7.2的缓冲溶液定容，此时测得的溶液的pH分别为2、10，测定溶液的吸光度随时间变化值。（2）取1.5mL稀释过的提取液于10mL比色管中，加入4.5mLpH=6.0的缓冲溶液，再加入4mL酪氨酸溶液，然后用pH=7.2的缓冲溶液定容，摇匀分别在热水浴30℃、50℃（3）取1.5mL稀释过的提取液于10mL比色管中，加入4.5mLpH=6.0的缓冲溶液，再加入4mL酪氨酸溶液，分别加入浓度为0.01827mol/L的EDTA1ml、2ml，然后用pH=7.2的缓冲溶液定容，测定溶液的吸光度随时间变化值。表1.4酶活性因素的测量时间（min）pH≈7（10℃）pH≈2pH≈10水浴30℃水浴40℃无EDTA1mlEDTA2mlEDTA10.1430.0420.0800.2250.1620.1630.1630.16120.1510.0460.0810.2260.1650.1660.1650.16430.1590.0420.0840.2300.1700.1710.1680.16640.1590.0420.0830.2380.1730.1720.1700.16850.1700.0400.0830.2430.1750.1760.1740.17160.1730.0380.0840.2490.1780.1780.1750.17370.1800.0370.0850.2550.1820.1820.1770.17480.1900.0370.0860.2630.1850.1880.1810.17690.1900.0370.0870.2700.1900.1920.1840.179100.2010.0360.0880.2760.1930.1960.1880.181110.2070.0320.0890.2840.1950.2000.1930.185120.2180.0290.0900.2900.1980.2060.1870.187六、结果讨论1、绘制不同酶加入量的动力学曲线：以吸光度为纵坐标，时间为横坐标，可得出在加入酶的作用下，酪氨酸转换的动力学过程，再由直线部分得出转换速率，即可计算酶的活性。依次得出不同提取液的活性。图1.2不同酶含量活性测量2、酶的活性计算：将不同体积提取液的实验结果填入下表，计算出原料中酶的活性。（酪氨酸的吸光系数为lgk=3.7）表1.5酶的活性计算已稀释的提取液体积/mL原提取液活性/mL-1原料活性/g-10.300.00614.0574.0340.400.00663.2923.2760.500.00823.2723.2553、影响酶的活性的因素研究：（1）pH值对酶活性的影响图1.3pH值对酶活性的影响由图1.3可知，在pH=2或10时，溶液吸光值基本不变，这说明酶在此环境下已经失去活性，而丧失其催化效果。（2）掩蔽剂EDTA对酶活性的影响图1.4EDTA对酶活性影响由图1.4可知，当加入EDTA后，曲线斜率明显下降，并且EDTA含量越高，曲线斜率越低，这表明当加入EDTA后酶的催化活性降低，并且EDTA含量越高，酶活性越低。（3）温度对酶活性的影响