靶向捕获测序

ed

Resequencing

TechnologySolution

&

Application解决方案PhD

WangGuanAbout

our

team

&

company同济医学院XX客户⼩小⿏鼠外显⼦子组捕获

20例；中南医院XX客户外显⼦子同济医学院XX客户低覆盖度全20例；组重

48例（CNV研究）项目（PCR-based

NGS

）成功完成的靶向重

项目（代表性客户列表）杭州浙医XX复杂流⾏行性疾病外显⼦子组600例；中⼭山医院XX客户XX肿瘤对照设计200例；医

学XX客户XX肿瘤对照设计40例；新华医院XX客户XX家系外显⼦子组

32例；胸科医院XX客户XX肿瘤

转移样本外显⼦子组

28例；医

学XX客户XX家系疾病40例；江苏

XX客户定制靶向捕获重

25例；8.9.10.11.12.13.14.肿瘤医院**肿瘤

43例，包含ctDNA-Seq第六人民医院骨质疏松科

25例外显子，6000例靶向重ＸＸ肿瘤医院ＸＸ客户１００例PCR-based

NGS……文章PublicationsAbout

our

team

&

companyAbout

our

team

&

company文章Publications文章PublicationsAbout

our

team

&

companyed

Resequencing

Intro完美结合的一种重

技术目标序列捕获技术是结合第二代高通量这样的策略将大大降低

DNA

的成本使您将有限的精力和投入与注在您所感针对目标区域设计特异探针幵将探针的区域在固相戒液相

上/戒PCR产物获得然后通过

杂交的方式将 组

DNA目标区域捕获（富集）下来后续用高通量

仪进

序分析ed

Resequencing

ProductsRoche

NimbleGen外显子组捕获产品Agilent外显子组捕获产品Illumina外显子组捕获产品Amplico

R-based

NGSLifeTech

PCR-based

NGSed

Resequencing

ProductsRoche

NimbleGen外显子组捕获产品Nimblegen采取高密度

式探针设计方案探针数量高达2,100,000,探针为55-105

mer

DNA数据可靠：NimbleGen序列捕获

用

质控探针来指示整个系统的运行情况，基于已知的独特

组位点，计算富集倍数。一性、高覆盖率：对指定区域采用advanced

repeat

masking方法设计探针，保证了很好均一性（uniformity）和覆盖率（coverage），可以有效捕捉到每个靶向序列，帮助用户对目标区域进行精确细致的分析，从而有效检测SNP突变。高度灵活性：捕获序列可以是连续的

组序列，或者是成千上万的独立位点或外显子序列；并丏可对接多家二代

平台。省时省力省成本：相比传统的PCR，SeqCap技术消除了建立和优化数千个PCR反应的繁琐步骤，更能同时并行的富集多个目标区域，极大地节约了时间和成本。ed

Resequencing

ProductsRoche

NimbleGen外显子组捕获产品1、gDN

段化，片段末端修复加接头，构建文库；2、捕获前对文库进行LM-PCR扩增；3、将扩增后的样品不

进行杂交；4、

，去除未结合序列，然后将捕获序列洗脱下来；5、对捕获后样品再次进行LM-PCR扩增；6、通过qPCR估计目标区域的相对富集倍数，达到质控要求后即可进

序前准备；7、高通量

分析。ed

Resequencing

ProductsRoche

NimbleGen外显子组捕获产品Roche

NimbleGen外显子组捕获

包括两种丌同的产品。SeqCap

EZ

Exome产品捕获区域达64

Mb，SeqCap

EZExome

+

UTR产品捕获区域达64

Mb

+

32

Mb。用于探针设计的数据库涵盖RefSeq,

Vega,

Gencode,

Ensembl,CCDS和miRBase，可更全面的覆盖编码区序列，捕获效率更高，可更为经济有效的发现

的编码区序列变异。Nimblegen外显子组捕获产品支持多个样品混合进行捕获实验。ed

Resequencing

ProductsRoche

NimbleGen液相捕获定制人类100kb-7M区域捕获产品货号Product

Code产品名称Description中文名称Chinese

Name包装Pack

Size系统类别System

Type6740251001SeqCap

EZ

Choice

Library,

4人类定制序列捕获EZ文库(4次反应)4适用于人类定制Reaction6266339001SeqCap

EZ

Choice

Library,

96人类定制序列捕获EZ文库(96次反应)96适用于人类定制Reaction6266347001SeqCap

EZ

Choice

Library,

384人类定制序列捕获EZ文库(384次反应)384适用于人类定制Reaction产品货号Product

Code产品名称Description中文名称Chinese

Name6953212001SeqCap

EZ

Reagent

Kit(24Rxn)SeqCap

EZ捕获实验配套试剂盒(24次反应)6977952001SeqCap

EZ

PureCapture

Bead

KitSeqCap

EZ捕获磁珠(24次反应)Roche

NimbleGen肿瘤

靶向捕获ent

designTrust

the

most

comprehensive

oncology

enrito

enhance

your

variant

discovery

and

detection.Optimize

throughput

and

sequencing

coverage

with

samplemultiplexing.1Minimize

sequencing

costs

with

the

superior

captureefficiency

of

our

2.1M

overlap

probes.1Clark

M,

et

al.Performance

comparison

of

exome

DNAsequencing

technologies.

Nat.

Biotech.2011

Sep

25;29(10):908-14;

:10.1038/nbt.1975ed

Resequencing

ProductsRocheNimbleGen肿瘤

靶向捕获ed

Resequencing

ProductsAgilent靶向捕获产品SureSelect是一套基于安捷伦卓越的寡核苷酸

技术的液相靶向序列捕获系统适用于仸何规模

研究项目的可缩放平台SureSelect系统仅仅需要3

µg的

组DNA这意味着研究者即使对珍贵样本也可以进行高通量的平行靶向Agilent平台使用114-126

mer

RNA做为探针探针数量655,872设计平台eArray（

/eArray）客户可以灵活定制最适合自身需求的序列捕获系统。每套序列捕获系统可以包含高达655,872条生物素标记的

“诱饵”寡核苷酸序列样品类型：细胞、新鲜组织或DNA样品。样品量：细胞样品请提供至少2×107个细胞，组织样品请提供至少100mg的组织块或切片，

DNA样品请提供10

μg以上的DNA。样品质量： 组

DNA无明显降解，主带清晰，大于

23Kb，无明显弥散。

OD260/280值在1.8~2.0之间，浓度≥500

ng/μl。样品保存：细胞样品或新鲜组织块（切成~50mg的小块）可液氮冻存后，-80℃保存。

DNA样品可溶于乙醇或超纯水中，-80℃保存。样品保存期间避免反复冻融。样品

：样品置于

1.5

ml管中，

膜封好，干冰

。ed

Resequencing

ProductsAgilent外显子组捕获产品Agilent

外显子组捕获 包括两种丌同的产品。SureSelect

Hum l

Exon产品的捕获区域为50Mb，

SureSelect

Hum l

Exon

+UTR产品的捕获区域为75

Mb。两种产品是基于寡核苷酸 技术的液相靶向序列捕获系统，提供了更高的 效率，幵全面覆盖了 的 组学数据库，包括RefSeq、CCDS、GENCODE、miRBase、TCGA

和

UCSC，全面覆盖外显子区域，幵保证高捕获均一性，有效降低 费用。ed

Resequencing

ProductsSureSelect

Performance

over

a

Diverse

Set

ofEnrient

DesignsSureSelectEnrient

Sequence

Coverageed

Resequencing

ProductsAgilent其他靶向捕获产品SureSelectXT

Clinical

Research

Exome

(54Mb)在Hum l

Exon

V5基础设计开发的试剂盒，可以覆盖人类疾病

绝大部分区域；达到80%捕获区域（含疾病）覆盖度>20X;

整合包含疾病

来自数据库：OMIM,ClinVar不HGMDed

Resequencing

ProductsAgilent其他靶向捕获产品SureSelectXT

Clinical

Research

Exome

(54Mb)客户可以定制区域提升至6Mbthe

Clinical

Research

Exome

enables

customization

through

the

addition

of

up

to

6Mb

of

content

usingSureDesigned

Resequencing

ProductsAgilent其他靶向捕获产品SureSelect

Focused

Exome只为研究疾病

而设计的靶向区域捕获产品疾病

整合自数据库：HGMD,

OMIM，ClinVar靶向区域累计长度大小12Mbed

Resequencing

Products•Agilent其他靶向捕获产品SureSelect

Focused

Exome数据量评测1.5Gb 数据（100X）>20X区域覆盖率95%3.0Gb 数据（200X）>20X区域覆盖率98%ed

Resequencing

ProductsAgilent其他靶向捕获产品Non-human

exomesAll

Exon

Mouse:49.6Mb

design.

Exon

definition

derived

from

Ensembl

+

RefSeq,

designed

against

mm9

reference

fromUCSCAll

ExonBovine:54Mb

design.

The

library

is

based

on

University

of

Maryland

build

3.1,

covers

coding

regions

as

well

asmiRNA

and

SNP s.

Developed

in

collaboration

with

the

USDA.All

Exon

Zebrafish:75Mb

design.

Zv9

library

is

in

Ensembl

and

is

annotated

with

gene

and

exon

coordinates.

Developed

incollaboration

with

the

Sanger.ed

Resequencing

ProductsAgilent其他靶向捕获产品Non-human

exomesSureSelect

Mouse

All

ExonKitFeature

SpecificationMouse

genome

/

exome

sourcecontentUCSC

mm9

/

NCBI

build

37

(July

2007)Total

capture

size

49.6

MBNumber

of

genes

covered

24,306Number

of

exons

221,784Average

exon

size

182

bpMedian

exons

per

gene

5Average

number

of

exons

per

gene

8um

exons

in

a

gene

347ed

Resequencing

Products灵活的捕获区域大小设计方案Flexibility

tocapture

from

1kb

to

24Mb采用SureDesign设计靶向区域探针Efficient

workflows

forpost-capture

(XT)

and

pre-capture

(XT2)

pooling按区域大小定制需要的试剂盒SureSelectXT

Custom

1Kb-499kb,16SureSelectXT

Custom

0.5-2.9Mb,16SureSelectXT

Custom

3-5.9Mb,16SureSelectXT

Custom

6-11.9Mb,16SureSelectXT

Custom

12-24Mb,

16Agilent其他靶向捕获产品Custom

SureSelectFig.

1

High

Percent

on and

Efficient

Coverageed

Resequencing

ProductsHiSeq

2500系统

提供了通量最高的

解决方案对于每次运行中数十个至数百个外显子组的MiSeq系统为靶向panel提供了一个优化的解决方案在单次运行中可

一个完整的人类外显子组Illumina外显子组捕获产品Illumina公司

的外显子组捕获产品Nextera

Rapid

caputure

Expanded

Exome

Kit，捕获区域为62Mb，包括外显子、miRNA

和UTR区域。

Illumina外显子组捕获产品最多可支持12个样品混合后进行捕获，且在低覆盖

度下混样捕获的均一性依然较好。此试剂盒对

组DNA的需求量低至50

ng。ed

Resequencing

Products简化的流程预先设计、与家选择的内容和成技术减少了分析优化时间和人为Illumina

NGS的风险准确的结果深度的均一覆盖实现了高度准确的变异检出增强的生产力产品批次检测、保质期延长和单一批号发货

的保持运行，同时降低成本；TruSight

One

Sequencing

Panel能够取代多个Illumina Panels捕获产品为了实现特定遗传病或疾病的经济、简化且靶向的新一代

（NGS），Illumina提供了TruSightsequencingpanels。由领先研究机构的知名医疗保健

设计，TruSightpanels包含寡核苷酸探针，靶定被认为与特定疾病相关的

和区域。每个TruSight

sequencing

panel提供了：ed

Resequencing

ProductsIllumina Panels捕获产品175

amplicon

CAP

，药物晚期临床实验发现的不实体肿瘤相关（AutismKB /

）常见肿瘤的易感性相关的肿瘤（GWAS研究）ed

Resequencing

ProductsIllumina Amplicons捕获产品TruSeq®

Amplicon

Cancer

Panel利用212个扩增子来检测48个

相关

中的突变区域，其中包括KRAS、EGFR

及BRAF。这些

与包含黑色素瘤、结肠直肠癌、

癌和肺癌等的许多

相关。利用TruSeq®

Amplicon，可以检测频率低于5%的突变，且每次运行提供多达1.5Gb的高质量数据。IlluminaMiSeq®操作平台一次可以同时运行96个样本的高度多重分析。因此，无论对于小型或者大型高通量

项目，完全有能力确保具有竞争力的项目交付时间。ed

Resequencing

ProductsIllumina Amplicons捕获产品TruSeq®

客户定制Amplicon

Panel单独一个反应最多丌超过1536个amplicons累计长度丌超过650

kb样本量满足150

ng-50

nged

Resequencing

Application丌同技术平台比较靶向捕获试剂盒捕获区域覆盖

数量DNA需求量illumina

TruSeqCustom

Amplicon

kit4Kb–200Kb1–30个200ngAgilent

HaloPlex

Enri ent

System4Kb–5Mb1–1000个200ngNimbleGen

SeqCap

EZ

Choice

Library100kb

–7Mb1–1500个3ugillumina

TruSeq

Custom

Enri entkit500Kb

–

25Mb>2000个3ugAgilent

SureSelect

Enri ent

System200kb

–34Mb>2000个3ugNimbleGen

SeqCap

EZ

Choice

XL

Library7Mb

–

50Mb>2000个3uged

Resequencing

ApplicationPipeline

foredResequencingregion

design设计及定制捕获试剂盒Sample

LIbraryRegion

captureHiseq2500

SequencingData

ysis

数据分析ed

Resequencing

Application方案1：定制捕获后poolinged

Resequencing

Application方案2：

PCR-based ed

sequencing(AmpliconsSeq)ed

Resequencing

Application方案2a：先混样后P iSeq

NGS序号步骤备注1血液样本提取一般选用qiagen试剂盒2引物Life公司

，引物设计费免3PCR条件摸索这步时间和成本丌好说，如果样本量大，这步基本免费，15%失败率4PCR批量PCR，酶必须采用高保真，这步也有可能需要部分重做5电泳检测跑电泳6混样，第二轮PCR亮度低的就多加点7纯化定量磁珠纯化82100检测Size检测ed

Resequencing

Application方案2b：先PCR，后混样,PCR，再纯化+MiSeq

NGS序号步骤备注1血液样本提取一般选用qiagen试剂盒2引物Life公司

，引物设计费免3PCR条件摸索这步时间和成本不好说，如果样本量大，这步基本免费，15%失败率4PCR批量PCR，酶必须采用高保真，这步也有可能需要部分重做5电泳检测跑电泳6第二轮PCR7电泳检测将条带亮度差不多的混合一起，做下一步纯化，这样可以节约纯化费用，不然单独纯化更贵8混样后再纯化定量磁珠纯化92100检测Size

检测ed

Resequencing

Application方案2c：先PCR，再纯化，建成（样本*引物）数目个文库，再混样+MiSeq

NGS序号步骤备注1血液样本提取一般选用qiagen试剂盒2引物Life公司

，引物设计费免3PCR条件摸索这步时间和成本丌好说，如果样本量大，这步基本免费，15%失败率4PCR批量PCR，酶必须采用高保真，这步也有可能需要部分重做5电泳检测跑电泳6第二轮PCR这步失败率很低，丌需要摸索7纯化定量磁珠纯化，因此也丌用继续跑电泳了8混样，2100检测Size检测这样相当于建了（样本*引物）数目个文库，以后哪些没测到，直接可以挑出来混就可以。而且可以随意混。其他方案，如果要重新，都要重新建库ed

Resequencing

ApplicationDataysised

Resequencing

ApplicationIntegrative

Data

ysis靶向捕获

功能

以及

组区域的深度挖掘遗传疾病OMIM数据库整合复杂疾病COSMIC数据库信息整合dbSNP数据库整合挖掘1000Genomes项目数据库整合分析NIH

6500外显子项目数据库整合分析GWAS数据整合ENCODE调控元件数据库整合转录因子结合transfac数据库miRbase数据库整合miRNA调控信息miRNA靶

数据库整合跨物种保守性分析14way蛋白突变危害性评价不ed

Resequencing

ApplicationSummary:capture

and

amplify

~10,000

human

exons

in

a

single

multiplex

reactioned

Resequencing

ApplicationSummary:captured

and

sequenced

44

candidate

genes

in

2446

ASDprobands.discovered

27

de

novo

events

in

16

genes,

59%

of

which

arepredicted

totruncate

proteins

or

disrupt

splicinged

Resequencing

ApplicationSummary:1.

Somatic

sequencing

of

cancers

has

produced

new

insight

intotumorigenesis,

tumor

heterogeneity,

and

disease

progression1.yzing

248

genes

solution

capture

of

DNA

followed

bymultiplexed,

high-throughput

sequencing2.

31

melanoma

cell

lines

and

18

tumor

tissues

from

patientswith

metastatic

melanoma.ed

Resequencing

ApplicationEuropean

Journal

of

Human

Genetics

(2014)

22,

528–534;Accurate

molecular

diagnosis

of

phenylketonuria

andtetrahydrobiopterin-deficient

hyperphenylalaninemiasusinghigh-throughput ed

sequencingPKU

苯

尿症;

BH4DH

高苯丙氨酸血症研究Summary:NimbleGen

SeqCap

EZ+和PAH,

GCH1,

PTS,

and

QDPRa

cohort

of

95

samples

with

the

previouslyknown

PAH,

GCH1,PTS,

and

QDPR

mutations

and

onecontrol

sample探索性研究：a

discovery

cohort

of

11

uncharacterizedHPApatients

using

a

MiSeq

sequencer：5.

report

the

precisecharacterization

of

the

breakpointsof

four

genomic

rearrangements

in

PAH,

including

anovel

deletion

of899

bp

in

intron

3ed

Resequencing

Application此方法适合的应用领域：somatic

mutation

intumors/controlscase-control

or

matched

sample

cohorts基于知识挖掘的

pannel研究基于GWAS结果的后期独立样本群体验证DNA

Pooling研究特色：采用NGS高通量

技术实现获取组SNP信息；采用DNApooling策略，高性价比；实现研究群体样本数目增大20X-50X倍；分析效能等价或超出独立

分析的策略基于

技术的GWAS分析，筛查包括common和rarevariants位点（常见变异不低频变异）超过领先于以往GWASSNP

技术策略；综合考虑疾病独特的治疗方案因素，考虑预后差异不易感性SNP的关联分析步骤DNA

Pooling靶向捕获重关联分析（GWS，genome-wide

association)ed

Resequencing

Application第二阶段研究外显子组Germline

mutation疾病组外周血DNA（20样本/pool)对照组外周血DNA（20样本/pool)靶向关联分析：确定易感性位点loci（snp/indel）Sanger

自身验证确定高

度易感性位点

loci（snp/indel）功能验证DNA

Pooling第一阶段研究DNA

Pooling混合池策略DNA

pooling方法可以提高群体样本信息容量通过对接高通量

平台探测低频变异不复杂性状的关联；识别易感DNA

Pooling混合池策略DNA

Pooling

+靶向

方法可行性论证采用base-calling

algorithm算法准确识别pool样本内存在的variantsNATURE

METHODS

|

ADVANCE

ONLINE

PUBLICATIONDNA

Pooling混合池策略pool

sequencing策略的关联分析效能评价经过比较分析，pool混合池样本大小不群体库总数目在case/control关联分析效能的比较ed

Resequencing

ApplicationDNA

Pooling案例ed

Resequencing

ApplicationDNA

Pooling案例ed

Resequencing

Application实验目的：外显子组技术应用于病程序列中的血样，用来实验样本：6实验方法：药物化疗病程的ctDNA突变体

（外显子组

）肿瘤突变变异体动态变化，识别到

药物抵抗相关突变体；探讨

肿瘤体细胞突变不ctDNA变异体AF

(allele

frequency)相关性。关键采用深度 计算AF值。并后续通过一系列统计方法比较分析出时间序列中哪些ctDNA突变存在显著差异性AF。结论：存在高度一致性。说明通过高通量技术可以对ctDNA突变体Af的

达到

肿瘤发展状态或治疗前后效果的目的。ed

Resequencing

ApplicationTime

courses

for

allele

fractions

(AF;

data

points)

of‘anchor’mutations

used

for

initial

fication

ofctDNA

levels,

the

fractionalconcentration

of

tumour

DNA(tumour

burden;

grey

dashed

lines).‘Anchor’

mutations

were

measured

using

digital

PCR

orTAm-Seqfor

all

available

plasma

samples,

and

usingexome

sequencing

at

selected

time

points

indicated

by

E1,

E2,

E3

(and

E4

and

E5

for

case

5).Tumour

burden

was

estimated

from

exome

dataECX,

epirubicin,

cisplatin

andcapecitabine;C-LD,carboplatinandliposomaldoxorubicin;LD,

liposomal

doxorubicin.ed

Resequencing

Applicationed

Resequencing

Application目的设计个性化

方法定量来自血液样本的CTC核酸浓度的动态变化趋势designed

alized

assaysto fycirculating

tumorDNA

in

serially

collected

plasma

specimens样本： 肿瘤与配对癌旁研究方法：采用靶向

和全

组

技术探查体细胞

组变异compared

the

radiographic

imaging

of

tumors

with

t