DNA甲基化检测技术应用与技术比较

DNADNADNA蛋白甲基化的联合作用机制、RNADNA从医学领域扩展到动植物争论当中，同时在争论方法上也取得了很大的突破。现在用于DNA的方法或许有十多种，从应用上来分，大致可以分成两类：全基因组甲基化分析及特异位点甲基化检测。下面，我们就这两大类检测技术进展分析比较，以便于在实际的科研工作中进展选择。一、全基因组甲基化检测技术基于芯片平台的全基因组甲基化筛选芯片平台作为目前比较成熟的筛选工具，已经在很多领域DNA相应的产品供给，其中应用最为广泛的就AgilentIlluminaAgilentHumanCpGIslandMicroarrayKit，InfiniumHumanMethylation27BeadChipInfiniumHumanMethylation450KBeadChipRocheNimbleGenAffymetrixNimbleGen产。不同的芯片平台，各自的试验过程也是不一样的。安捷伦DNA〔MeDIP〕技术。将基因组DNA分成两份，一份用来做MeDIP，Cy5Cy3Cy5/Cy3例显示出该区域的甲基化程度。eArray以进展芯片的定制。在甲基化领域同样适用。AgilentMeDIPIlluminaInfiniumGoldenGate术却做得到。IlluminaInfiniumSNP检测，承受的是单碱基延长的原理。分析利用两个位点特异的探针检测这些序列差异的位点，一个探针是为甲基化位点(M磁珠类型)设计的，而另一个是为未甲基化位点(U碱基延长掺入了一个标记的ddNTP，它随后被荧光试剂染色。通过计算甲基化与未甲基化位点的荧光信号比例，可确定检测位点的甲基化水平。IlluminaInfiniumHumanMethylation27BeadChip27,578CpG领域有广泛的应用，除了和肿瘤相关的甲基化筛选之外，也能用于其他疾病相关甲基化检测。因此对这款产品，争论者赐予了很高的评价，目前此InfiniumHumanMethylation450BeadChip45CpGCpGCpGCpG肿瘤和正常组织中差异表达的甲基化位点等等。它的高覆盖度、高通量以及低价格，让它成为进展全基因甲基化筛选的有力武器。相比之下，VeraCode，它以以矩阵微珠芯片(SentrixArrayMatrix(SAM)〕48384CpG。首先，将亚硫酸氢盐处理的基因组DNAoligooligoUColigoPCRPCRCpGIlluminaCpG基于高通量测序平台的甲基化图谱分析随着二代测序技术的告知进展，测序本钱大幅度下降，使得真正实现全基因组甲基化分析的争论成为可能。随着人类甲基化图谱绘制成功，已经间续有多个物种的甲DNA法，如亚硫酸氢盐转化与高通量测序相结合，可以实现单碱基精度的甲基化图谱的构建。此外将成熟的MeDIP技术与二代测序相结合，可以快速有效地查找基因组上的甲基化区域，从而比较不同细胞、组织、甚至疾病DNA该技术也特别适用于大样本量的疾病表观争论。第三代测序技术的消灭，更是让甲基化的直接测定成为可PacificBiosciences子实时(SMRTDNA成果发表在《NatureMethods》杂志上。二、特异位点甲基化检测技术应用比较1PCR〔MS-PCR〕DNADNACpGC转变为U，假设有甲基化则PCR，即可CpG甲基化。因此依据目的基因修饰前后的转变，就可以相应MU这种方法灵敏度高，无需特别仪器，因此经济有用，是目前应用最为广泛的检测方法。不过也存在确定的局限性，DNA要。另外，亚硫酸氢盐处理也格外关键，假设处理不完全则可能导致假阳性的消灭。PCR(BSP)DNA程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，设计引物进展PCRPCRCpG甲基化。这种方法牢靠，且准确度高，能明确目的片段中CpG测序，其结果准确但要求克隆时所挑克隆较多，操作繁琐，不易大批量操作。另外，甲基化程度的定量依靠于挑选克隆的数目，因此这种方法只能算得上是一种半定量的技术方法。BSPMSPPCR本的筛选。甲基化敏感性高区分率熔解曲线分析(MS-HRM)通过熔解曲线分析可以将单碱基序列的差异转变成熔解曲DNADNA通过熔解曲线分析来觉察。使用该方法进展甲基化分析仅需一对引物，相对简洁，不过这种方法对仪器的要求颇HRMPCRPCR化状况进展分析，并不能明确每个CpG点的甲基化状态。因此这种技术适用于大量样本的检测，CPG点的准确检测及甲基化程度的准确定量。联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法〔COBRA〕这种方法是将亚硫酸氢盐处理与酶切相结合来进展甲基化检测。DNA样本经亚硫酸氢盐处理后，利用PCR扩增。扩增产物纯化后用限制性内切酶〔BstUI〕C(5mCG5mCG)，则PCR扩增后保存为CGCG，BstUI能够识别并进展切割；假设待测序列中，C未发生甲基化，则PCR后转变为TGTG，BstUI识别位点丧失，不能进展切割。这样酶切产物再经电泳分别、探针杂交、扫描定量后即可计算出原样本中甲基化的比例。这种方法最大的优点就是相对简洁，可进展快速定量，且需要的样本量少。然而，它的局限性也格外明显，只能获得特别酶切位点的甲基化状况，且阴性结果并不能排解样品DNA中存在甲基化的可能。荧光定量法〔Methyligh〕MSPMSP利用荧光染料进展定量。TaqMan?探针法的应用使得该技术具有更高的准确性。其原理与SNPDNA甲基化位点上会存在单碱基的差异，依据这种差PCR，就能够检测甲基化的差异。这种方法最大的优势在于其高敏感性和较高PCRTaqMan?探针订购费用较高，适用于少数位点大量样本筛选。焦磷酸测序(Pyrosequencing)随着技术的不断改进，现在认为焦磷酸测序技术〔Pyrosequencing〕是甲基化检测的金标准。焦磷酸测序作为一种的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进展定性及定量检测，为甲基化争论供给了的途径。在序列延长过程CTC-T比例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确检测，并给出准确的甲基化程度的数据。QIAGEN供给三种焦磷酸测序仪器，通量由低到高，适合不同的应用。PyroMarkQ2424PyroMarkQ96ID上进展。在考虑处处理成百上千个样品所需的大量试剂时，运行通量最大化可能会使试验本钱变得很高。而PyroMarkQ96MD装有一台高度灵敏的光检测摄像头，可以在削减试剂量DNA的推出，对于我们实际争论供给了更有效的检测手段。虽然焦磷酸测序可以进展单个位点甲基化程度的准确定量，但是目前来看，测序的片段长度还比较短，只有一百bp60bp。以上是对几种常用的特异位点甲基化检测方法进展