ExoIII介导的LIC高效克隆系统的建立及载体重建

ExoIII介导的LIC高效克隆系统的建立及载体重建

答辩人：梁耀极导师：韩家淮L

I

C背景

实验过程

总结一、LIC背景经典连接克隆方法的极限：长片段进大载体难度大；酶切位点有限，受酶切位点限制大。带缺口和突出端的DNA复合物在细菌中能被有效地修复L

I

CLigationIndependentCloningLIC原理载体和目的片段间，只要带有足够长的同源粘性末端（>8bp），经退火，转化E.coil.即可获得完整的质粒DNA如何获得粘性末端如何获得同源序列获得粘性末端ExoIII

全名ExonucleaseIII(核酸外切酶III)，其具有3’=>5’的外切酶活性获得5'粘性末端获得粘性末端ExoIII

全名ExonucleaseIII(核酸外切酶III)，其具有3‘=>5’的外切酶活性：具有从平末端消化dsDNA的外切酶活性；具有从5‘突出端消化dsDNA的外切酶活性；不具有从3‘突出端消化dsDNA的外切酶活性。获得5'粘性末端用ExoIII处理具有同源序列的载体和片段：InsertVectorInsertVector(overlap)(overlap)ExoIIIAnealingInsertVector在用ExoIII处理载体和片段，获得粘性末端的同时势

必会出现两种不可避免情况：1.InsertVectorInsertVectorGap2InsertVectorOverhang(cohesivearedifferentinlength)(cohesivearedifferentinlength)InsertVector获得同源序列用带同源序列的引物对目的基因进行扩增，即可获得带同源序列的目的片段和载体。VectorGeneGene引物我们最关注的问题是：采用ExoIII是否能进行高效的克隆？ExoIII的验证条件的优化和系统的建立载体重建二、实验过程用ExoIII进行处理，能够达到高效克隆的目的PET28a100ng4ulGene-A3100ng1ulDdw4ul转化、涂板10ⅹExoⅢbuffer1ul+ExoIII20units

室温

5min5个克隆寻求适合的条件来延长ExoIII处理的时间15h条件优化一4℃,60minutes条件优化二25-50ng载体和片段条件优化三Insert/Vestor≧2/1最高效的克隆条件用ExoIII（20units）处理含目的片段和载体的反应体系；4℃

下反应1h；保证目的片段和载体的浓度在25-50ng之间；保证目的片段和载体的摩尔比在2/1左右。最高效的克隆条件用ExoIII（20units）处理含目的片段和载体的反应体系；4℃下反应1h；保证目的片段和载体的浓度在25-50ng之间；载体重建pBKSpcDNA3.1pcDNA6pBOB-CMV通用序列：（No-tag）GGTACCATCGATGAATTCGATATCAGATCT

GGATCCGTTAACAGGCCTTCTAGACTCGAGAAGCTTCCCGGGTAGGTCGAC

GAGCTCKpnIClaIEcoRIEcoRVSalIBamHIHpaIStuIXhoIBglIIHindIIISmaIXbaISacIN-terminalC-terminal经改造的载体都带上了共有的序列我们所获得的带通用序列的载体：pBKS-CSpcDNA3.1-CSpcDNA6-CSpBOB-CSpBKS-N-FlagpcDNA3.1-N-FlapcDNA6-N-FlagpBOB-N-FlagpBKS-N-HApcDNA3.1-N-HApcDNA6-N-HApBOB-N-HApBKS-N-MycpcDNA3.1-N-MycpcDNA6-N-MycpBOB-N-MycpBKS-C-FlagpcDNA3.1-C-FlagpcDNA6-C-FlagpBOB-C-FlagpBKS-C-HApcDNA3.1-C-HApcDNA6-C-HAp