酶联免疫吸附试验诊断技术课件

酶联免疫吸附试验诊断技术

11/20/20221一、免疫检测的基础知识二、ELISA试验的原理三、ELISA试验的特点四、操作要领概要11/20/20222前言

免疫测定（immunoassay,IA）是应用免疫学技术测定样品的方法。在临床诊断中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗原或抗体性物质。在抗原或抗体上标记乳胶、金属颗粒、放射性同位素或酶，可以提高免疫测定的敏感性。11/20/20223一、免疫检测的基础知识（一）抗原（二）抗体（三）抗原抗体反应

11/20/20225（一）抗原(AntigenAg)抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。可刺激机体产生体液免疫（抗体）和引起细胞免疫（细胞因子）。能在机体中产生抗体的抗原多为分子量大于5000D的蛋白质，例如禽流感、新城疫、猪瘟、口蹄疫等病毒。

11/20/20226（二）抗体（AntibodyAb）

抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。抗体的产生机体受抗原刺激后，B淋巴细胞产生相应的抗体,含有抗体的血清称为抗血清（antiserum）。

11/20/20227（三）抗原抗体反应1、特异性结合并可逆抗原与抗体结构可以形成特异性的抗原抗体复合物，此过程是可逆的。2、最适比例：前带和后带现象3、敏感性11/20/20228ESP样品稀释包被（抗原或抗体）酶标复合物底物现色ELISA(间接)的操作步骤11/20/202210三、酶联免疫吸附试验的特点

（一）灵敏度高（二）特异性强（三）简便、快速（四）重复性好（五）自动化程度高，适合大批量标准化检测（六）安全

11/20/202212其他1、酶标比色仪2、洗板机11/20/202214严格遵守实验室生物安全管理制度

严禁吸烟、吃东西和嬉戏打闹！

移液器是精密仪器，请小心使用。实验操作注意事项11/20/202215试剂盒组成1.已包被抗原的ELISA板两块（每个组用一块板）2.洗涤液（25×）30mL3.阴性对照血清0.05mL4.阳性对照血清0.05mL5.血清稀释液30mL6.酶标记IgG(100×)0.1mL7.底物溶液A1mL8.底物溶液B 胶囊（2） 9.终止液 12mL11/20/2022161：20倍血清样品稀释方法：先取样品稀释液47.5ul加到酶标孔中。然后取2.5ul待检血清，加入样品孔中混匀。11/20/202217操作步骤：（1）加入血清样品：用血清稀释液对阳性和阴性标准血清做1：20稀释，每孔加入50μL，阴、阳性标准血清各做两孔；同时设两孔不加任何血清样品的空白对照孔。密封，37℃结合45分钟。（注意：此时的枪头不应重复使用，否则将造成交叉污染）。（2）洗板：弃去孔内液体，然后将25×洗涤液用灭菌水或超纯水稀释成1×工作液，每孔加入220-300μL洗板，重复4次，最后一次弃净孔内液体。（3）加入酶标二抗：浓缩酶标记抗体用血清稀释液做1：100稀释，每孔加入50μL，密封，37℃结合45分钟。（注意：从加入第一孔时开始计时间）。（4）重复步骤（2）洗板。（5）加入底物：将底物A和B做1：50体积混匀，每孔加入50μL，轻轻震荡混匀，密封，37℃或避光作用15分钟。加样的顺序应同步骤（3）保持一致，从加入第一孔时开始计时间。（6）终止反应：每孔加入50μL终止液，轻摇混匀，测定吸光度OD450nm。11/20/202218注意事项！！！

除洗涤缓冲液，其他试剂盒酶标板应取出在4℃条件下，使用前平衡至室温。特别提醒！！！底物溶液A在低温下呈固态，所以实验一开始可将其放置在室温。冻存的血清样品，最好先在4℃环境中使其融化，如果需要测量不同的指标，应该避免反复冻融样品，待测样品出现溶血的情况时，可高速离心后再进行试验，不影响结果。实验操作过程中，不要吸烟吃东西和交谈。洗涤缓冲液和酶标抗体现用现稀释，否则工作浓度