酵母双杂交体系Yeasttwo-hybridsystem酵母双杂交课件

酵母双杂交体系Yeasttwo-hybridsystem酵母双杂交体系Yeasttwo-hybridsystem1酵母双杂交(yeasttwohybrid)技术是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用的技术.酵母双杂交(yeasttwohybrid)技术是利用2背景知识真核生物转录起始前区域结构: -25bp区有：TATA序列称为Hogness盒或TATAbox，为启动子核心序列。

上游更远处增强子统称顺式作用元件背景知识真核生物转录起始前区域结构:3转录因子能直接或间接辨认和结合上游区段DNA的蛋白质----反式作用因子.其中能直接或间接与RNA聚合酶结合的称为转录因子(TF).相应于RNA聚合酶ⅠⅡⅢ的转录因子为TFⅠ,Ⅱ,Ⅲ真核生物的TFⅡ又分为TFⅡA与TFⅡB转录因子能直接或间接辨认和结合上游区段DNA的蛋白质----4真核生物转录起始前复合物TFⅡD识别TATATFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA复合体TFⅡB为桥梁并提供结合表面,促使TFⅡF-RNApol复合结构进入启动子核心区TATA.TFⅡE的ATPase分解ATP,解开DNA双螺旋.TFⅡH进入完成转录起始前复合物(PIC)启动合成RNA第一个碱基.真核生物转录起始前复合物TFⅡD识别TATA5真核转录因子的结构域两个结构域DNA结合结构域(DNA-bindingdomain，BD)一个或多个与其他调控蛋白相互作用的转录激活结构域(activationdomain，AD)真核转录因子的结构域两个结构域6酵母转录因子GAL4结构特点

GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域.

两结构域：DNA结合域转录激活域特点：结构上可分开、功能上相互独立酵母转录因子GAL4结构特点GAL4包括两个彼此分离的但功7基本原理DNA结合域（DNA-BD）：N端1-147氨基酸转录激活域（AD）：C端786-881氨基酸基本原理8DNA-BD：识别GAL4效应基因上游的激活序列（UAS），并与之结合AD：通过同转录机制(transcriptionmachinery)的其它成分之间的结合以启动上游激活序列（UAS）下游的基因转录。DNA-BD：识别GAL4效应基因上游的激活序列（UAS）9用DNA重组技术，将DNA-BD和AD分开，并放在同一宿主细胞中表达。用DNA重组技术，将DNA-BD和AD分开，并放在同一宿主细10将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Baitprotein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Baitprotein。将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Baitprotein11将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。产生的GAL4DNA-BD和AD多肽不直接发生相互作用，不能激活相关的效应基因进行转录将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRAR12同时用上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中不能产生GAL4。同时用上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基13GAL4的DNA-BD和蛋白质X结合形成杂种蛋白，与GAL1的UAS序列结合，但由于无AD的参与，报告基因不转录。GAL1UAS（上游激活序列）启动子LacZ(报告基因)DNA-BD蛋白质XGAL4的DNA-BD和蛋白质X结合形成杂种蛋白，与GAL114GAL4的AD同蛋白质Y结合，形成的杂种蛋白，未与UAS序列结合，不能启动报导基因转录。GAL1UAS（上游激活序列）启动子LacZ(报告基因)AD蛋白质YGAL4的AD同蛋白质Y结合，形成的杂种蛋白，未与UAS序列15通过此两个杂种蛋白中的X与Y的相互作用，在细胞内重建了GAL4的功能，启动报导基因表达。GAL1UAS（上游激活序列）启动子LacZ(报告基因)通过此两个杂种蛋白中的X与Y的相互作用，在细胞内重建了GAL16缺陷型宿主菌株常见的有SF562和HF7c.特点：无表达GAL4转录激活因子的能力缺陷型宿主菌株常见的有SF562和HF7c.17载体------穿梭质粒pGBT9,又称DNA-BD质粒载体。靶基因插入可与GAL4-BD形成融合蛋白Ⅰ。pGAD424，又称AD质粒载体。靶基因插入可与GAL4-AD形成融合蛋白Ⅱ。二者均可在大肠杆菌和酿酒酵母中自主复制。两种融合蛋白可在酵母中高表达。在核定位序列作用下，进入酵母细胞核内。载体------穿梭质粒pGBT9,又称DNA-BD质粒载18（ADH1:醇脱氢酶1）（ADH1:醇脱氢酶1）19酵母双杂交体系Yeasttwo-hybridsystem酵母双杂交课件20实验程序1分别重组两种穿梭质粒载体。2分别导入E.coli培养。3分别提取两种质粒。4转化酵母菌5筛选阳性克隆实验程序1分别重组两种穿梭质粒载体。21酵母双杂交体系Yeasttwo-hybridsystem酵母双杂交课件22应用---蛋白质相互作用筛选单抗蛋白质-蛋白质相互作用筛选酶抑制剂…应用---蛋白质相互作用筛选单抗23酵母双杂交体系Yeasttwo-hybridsystem酵母双杂交体系Yeasttwo-hybridsystem24酵母双杂交(yeasttwohybrid)技术是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用的技术.酵母双杂交(yeasttwohybrid)技术是利用25背景知识真核生物转录起始前区域结构: -25bp区有：TATA序列称为Hogness盒或TATAbox，为启动子核心序列。

上游更远处增强子统称顺式作用元件背景知识真核生物转录起始前区域结构:26转录因子能直接或间接辨认和结合上游区段DNA的蛋白质----反式作用因子.其中能直接或间接与RNA聚合酶结合的称为转录因子(TF).相应于RNA聚合酶ⅠⅡⅢ的转录因子为TFⅠ,Ⅱ,Ⅲ真核生物的TFⅡ又分为TFⅡA与TFⅡB转录因子能直接或间接辨认和结合上游区段DNA的蛋白质----27真核生物转录起始前复合物TFⅡD识别TATATFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA复合体TFⅡB为桥梁并提供结合表面,促使TFⅡF-RNApol复合结构进入启动子核心区TATA.TFⅡE的ATPase分解ATP,解开DNA双螺旋.TFⅡH进入完成转录起始前复合物(PIC)启动合成RNA第一个碱基.真核生物转录起始前复合物TFⅡD识别TATA28真核转录因子的结构域两个结构域DNA结合结构域(DNA-bindingdomain，BD)一个或多个与其他调控蛋白相互作用的转录激活结构域(activationdomain，AD)真核转录因子的结构域两个结构域29酵母转录因子GAL4结构特点

GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域.

两结构域：DNA结合域转录激活域特点：结构上可分开、功能上相互独立酵母转录因子GAL4结构特点GAL4包括两个彼此分离的但功30基本原理DNA结合域（DNA-BD）：N端1-147氨基酸转录激活域（AD）：C端786-881氨基酸基本原理31DNA-BD：识别GAL4效应基因上游的激活序列（UAS），并与之结合AD：通过同转录机制(transcriptionmachinery)的其它成分之间的结合以启动上游激活序列（UAS）下游的基因转录。DNA-BD：识别GAL4效应基因上游的激活序列（UAS）32用DNA重组技术，将DNA-BD和AD分开，并放在同一宿主细胞中表达。用DNA重组技术，将DNA-BD和AD分开，并放在同一宿主细33将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Baitprotein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Baitprotein。将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Baitprotein34将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。产生的GAL4DNA-BD和AD多肽不直接发生相互作用，不能激活相关的效应基因进行转录将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRAR35同时用上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中不能产生GAL4。同时用上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基36GAL4的DNA-BD和蛋白质X结合形成杂种蛋白，与GAL1的UAS序列结合，但由于无AD的参与，报告基因不转录。GAL1UAS（上游激活序列）启动子LacZ(报告基因)DNA-BD蛋白质XGAL4的DNA-BD和蛋白质X结合形成杂种蛋白，与GAL137GAL4的AD同蛋白质Y结合，形成的杂种蛋白，未与UAS序列结合，不能启动报导基因转录。GAL1UAS（上游激活序列）启动子LacZ(报告基因)AD蛋白质YGAL4的AD同蛋白质Y结合，形成的杂种蛋白，未与UAS序列38通过此两个杂种蛋白中的X与Y的相互作用，在细胞内重建了GAL4的功能，启动报导基因表达。GAL1UAS（上游激活序列）启动子LacZ(报告基因)通过此两个杂种蛋白中的X与Y的相互作用，在细胞内重建了GAL39缺陷型宿主菌株常见的有SF562和HF7c.特点：无表达GAL4转录激活因子的能力缺陷型宿主菌株常见的有SF562和HF7c.40载体------穿梭质粒pGBT9,又称DNA-BD质粒载体。靶基因插入可与GAL4-BD形成融合蛋白Ⅰ。pGAD424，又称AD质粒载体。靶基因插入可与GAL4-AD形成融合蛋白Ⅱ。二者均可在大肠杆菌和酿酒酵母中自主复制。两种融合蛋白可在酵母中高表达。在核定位序列作用下，进入酵母细胞核内。载体------穿梭质粒pGBT9,又称DNA-BD质粒载41（ADH1:醇脱氢酶1）（ADH1:醇脱氢酶1