液相色谱维护柱子使用及保养（八）

液相色谱实用技术

色谱柱的使用和保养Ci=Ai×C标/A标

含量％＝Ci/M×100％

标示量＝Ci/M×片重×系数

样品：1.门东氨酸(Asp)2.丝氨酸(Ser)3.谷氨酸(Glu)4.甘氨酸(Gly)5.组氨酸(His)6.氨(NH3)7.精氨酸(Arg)8.苏氨酸(Thr)9.丙氨酸(Ala)10.脯氨酸(Pro)11.光氨酸(Cys)12.酪氨酸(Tyr)13.缬氨酸(Val)14.蛋氨酸(Met)15.赖氨酸(Lys)16.异亮氨酸(ILeu)17亮氨酸(Leu)18.苯丙氨酸(Phe)分析条件：DIONEX-SummitHPLC检测器：UV248nm柱：氨基酸分析柱或C18柱流动相：A：乙酸纳缓冲液B：60％乙晴水溶液0-67%B(6-8步梯度洗脱)ml/min样品:10ul17种氨基酸的HPLC分析(标准)样品：1.门东氨酸(Asp)2.丝氨酸(Ser)3.谷氨酸(Glu)4.甘氨酸(Gly)5.组氨酸(His)6.氨(NH3)7.精氨酸(Arg)8.苏氨酸(Thr)9.丙氨酸(Ala)10.脯氨酸(Pro)11.光氨酸(Cys)12.酪氨酸(Tyr)13.缬氨酸(Val)14.蛋氨酸(Met)15.赖氨酸(Lys)16.异亮氨酸(ILeu)17亮氨酸(Leu)18.苯丙氨酸(Phe)色谱柱的选择非极性或极性较小的样品可用一般的C18柱酸碱性的化合物建议选用填料经封尾钝化过的C18柱，PH范围2-9〔12〕糖类，氨基酸，有机酸，多环芳烃，GPC有专用柱?超快速柱子-填料粒度<2µm键合相色谱柱以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上作为固定相。这种固定相要占所有柱填料的60-70%优点∶固定相稳定，不易流失应用广泛，可使用多种溶剂消除硅羟基的不良影响缺点∶pH值不能小于2或大于8同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同反相HPLC柱〔C18〕的性能常规C18填料的稳定性硅胶基质填料pH范围：2-8pH值大于7时

键合相粉碎或溶解pH值小于2时

键合相的化学键断裂经常用缓冲液固定相降解填料新的键合技术-PH范围2-12-稳定性好，使用寿命长良好的色谱实验习惯拿到一根新色谱柱时，先测柱效保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件定期检测柱效色谱柱的使用及操作流动相的转换特别是GPC柱流速(压力)的变化幅度温度的变化幅度专用色谱柱∶样品及溶剂的要求色谱柱的保养〔一〕样品方面除去微粒及杂质了解样品在流动相中的溶解度如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用样品准备为什么溶剂和样品要过滤?

溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。样品过滤头的类型：30mm内径：适用于大进样量的过滤，由μm和μm两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50μl。13mm内径：适用于范围广的过滤，由μm和μm两种规格,材料为纤维素。3mm内径：适用于小进样量的过滤，由μm和μm两种规格。处理样品体积为7μl。色谱柱的保养〔二〕流动相方面除去微粒纯度的要求超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低〔建议走空白检验〕缓冲液的pH值，在填料的允许范围内缓冲液〔盐〕的浓度溶剂：色谱纯，并与填料相匹配溶剂中的杂质含量注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂流动相对样品的溶解度有机溶剂或水的比例溶剂过滤-除去微粒

不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶剂过滤器以及色谱柱。遵从以下建议可以提高性能，延长溶剂过滤器和色谱柱的寿命：使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌。用滤膜过滤溶剂去除微生物。每两天更换或过滤溶剂。避免溶剂瓶直接日照。向溶剂中加入M的叠氮化钠。

溶剂准备：过滤

选择合适的滤膜

聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。醋酸纤维滤膜：适用于水基溶剂，不适用于有机溶剂，推荐用于蛋白质和其相关的样品。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸、70%乙醇、二氯甲烷、不适用于DMF二甲基甲酰胺再生纤维素滤膜：具有蛋白质吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂。注意：1〕每张滤膜只能用一次。2〕水相和有机相不要搞混。溶剂的相溶性

溶剂信息

避免使用以下对不锈钢有腐蚀性的溶剂：卤化物碱金属溶液和相应的酸溶液。高浓度的无机酸例如：硝酸和硫酸。能够形成卤素自由基或酸的氯化试剂及其混合物。含有过氧化物的色谱级醚必须用氧化铝干燥剂。在有机溶剂中的有机酸溶液。含有强络合剂的溶液。四氯化碳和异丙醇或THF混合液。溶剂截止波长

溶剂准备：脱气流动相使用前为什么要脱气？

流动相使用前必须进行脱气处理，以除去其中溶解的气体〔如O2〕，以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。假设用FLD，可能会造成荧光猝灭。常用的脱气方法比较：

氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染抽真空脱气法：易抽走有机相。超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。在线真空脱气法：LC真空脱机利用膜渗透技术，

在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。

典型的流速

色谱柱日常使用过滤所有的溶剂和样品使用保护柱不要把柱接头上得太紧，损坏接头螺纹易渗液开机时，流速和柱压要逐渐增加进样前检查色谱系统的各个接头是否有漏液注意色谱柱的pH值使用范围不要高温下过长时间使用硅胶键合相柱子关机前先用水冲洗整个系统，移走缓冲液后再用有机相冲洗不要高压冲洗柱子色谱柱保护

在线的保护装置给色谱柱提供物理的保护除去样品及流动相中的颗粒给色谱柱提供化学的保护防止分析柱被化学污染装置在线过滤器自装填料保护柱预装保护柱在线过滤器在线过滤器防止颗粒在色谱柱头累积优点：基本不影响柱效在需要高柱效的分析时中常用〔如：氨基酸分析〕可更换的消耗品更换滤芯更换垫圈保护柱可避免化学污染。多数保护柱影响到整个色谱柱的柱效，特别是在用微柱时保护柱的种类普通自装填料的保护柱用户自装填料影响柱效同装填技术有关，柱效降低较大OnGuard预装保护柱有各种填料的预装柱供选择，使用方便。填料容积较小，也引起柱效降低新型的保护柱适应的用户类型非常脏,非常复杂的样品本底生化样品,溶液环境样品食品不想作太多的固相萃取不想降低柱效新型的保护柱特点高质量,高效填料-不损失柱效增加分析柱效-增加适应范围20mm柱长-脏样品载荷能力大，能延长保护柱寿命手可拧紧接头，安装时不需要工具通用柱套-适用于所有的HPLC柱及内径)整体式-使用方便，容易各种不同填料配合色谱柱色谱柱常见毛病柱压过高多少才算高?不同色谱柱有差异不同系统有差异不同溶剂有差异柱效低重复性差不出峰，回收率低柱压过高为什么柱压会过高微粒堵塞样品流动相密封垫柱床膨胀不可逆吸附细菌生长柱效低为什么柱效低色谱柱被污染过滤片部分堵塞样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞色谱柱内的死体积流动相pH值及组成不合适造成固定相流失流速急剧变化造成固定相物理损坏机械震动造成固定相产生裂缝柱床收缩或干枯重复性差、回收率低实验的重复性差色谱柱被污染流动相pH值及组成不合适造成键合相流失样品溶剂不同或样品本身不稳定回收率低，不出峰“不可逆〞吸附固定相过强或流动相过弱非特异性吸附色谱柱的日常清洗对所做的样品要有充分的了解用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗〔如反相C18柱用100%甲醇或乙腈〕硅胶柱的一般方法先用甲醇洗去极性杂质，再用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化键合相柱(烷基)的一般方法20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗柱子尺寸柱子体积冲洗体积150x4.6mm2.5ml50ml200x4.6mm3.3ml65ml250x4.6mm4.2ml80ml**再有杂质严格清洗：20倍柱体积的水-相同体积的mol/L硫酸，最后用流动相清洗色谱柱的清洗-物理阻塞在安装柱前后测试压力差如果柱压力太高，反装色谱柱，并用10-20倍柱体积的流动相冲洗色谱柱，监测压力变化假设出现沉淀(如：蛋白凝聚、细胞物、聚合物)设法用相应的可溶性溶剂，如0.1%TFA/80%乙腈,6M盐酸胍,THF,HFIP假设仍无效，应考虑更换过滤片色谱柱头塌陷的修补

柱头有塌陷可用填料修补：1〕松开柱入口接头，拆下不锈钢烧结过滤器，常见柱头塌陷，剔掉无规那么床层和带色填料，使柱床呈白色水平面，滴一滴甲醇，加少许填料使沉降，如此反复多次后，用刮刀将填料刮平，放上清洗过的不锈钢烧结过滤器，装上柱入口接头，把柱重新接到LC仪器上慢慢地增加流速，直到操作上限为止。2〕如果柱头塌陷较深〔小于1cm〕可逐渐减低流速至零，再次拆下柱子，用填料修补直到塌陷填满为止。色谱柱的存放存放前的处理除去杂质、盐等，防止细菌生长合适的存放溶剂两端密封保存，避免色谱柱床干枯避免机械震动注意存放的温度色谱柱以外的因素〔一〕“柱效〞问题，不一定是色谱柱问题！仪器问题：连接不好造成死体积进样器检测器管路，连接口保护柱在线过滤器堵塞流动相问题：色谱柱未平衡好进样量太大色谱柱与仪器的联接不同公司产品，其接头不同。处理不当时，会造成：色谱峰展宽〔死体积〕使柱效下降、或渗漏解决办法：自制相应的转换接头使用“通用〞型接头〔锥箍及螺母〕这种锥箍在不锈钢管上是活动的，因此可以换接不同的色谱系统及色谱柱。PEEK工程塑料的接头，可用在所有类型的色谱柱上的。色谱柱以外的因素〔二〕柱压过高问题，不一定是色谱柱问题！系统反压问题阻尼器堵塞进样器堵塞管路或连接口堵塞在线过滤器不干净保护柱压力传感器不准确流速是否错误?色谱柱以外的因素〔三〕实验的重复性差梯度实验时平衡时间不足温度波动流动相组成改变样品溶剂不同样品稳定性不好方法的开发不好缓冲液的pH值不合适缓冲液的缓冲能力不足手动进样器-六通阀的结构手动进样器清洗为避免出现怪峰，冲洗注射针时最好用流动相〔不含盐〕冲洗液相色谱实用技术

色谱柱的使用和保养极性问题通过改变流动相改变α，同样强度的不同溶剂改变色谱柱2.改变分离因子α分配色谱的分离机理分配色谱概述反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱常用的流动相：有机溶剂如甲醇、乙腈，四氢呋喃，水应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法常用固定相：碳十八、碳八、胺基、氰基，二醇基等基团反相色谱固定相大多数为键合相键合相色谱柱以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。优点∶固定相稳定，不易流失应用广泛，可使用多种溶剂消除硅羟基的不良影响缺点∶pH值不能小于2或大于8同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同反相HPLC柱〔C18〕的性能常规C18填料的稳定性硅胶基质填料pH范围：2-8pH值大于7时

键合相溶解pH值小于2时

键合相水解经常用缓冲液固定相降解填料新的键合技术-PH范围2-12-稳定性好，使用寿命长色谱柱的选择非极性或极性较小的样品可用一般的C18柱酸碱性的化合物建议选用填料经封尾钝化过的C18柱，PH范围2-9〔12〕糖类，氨基酸，有机酸，多环芳烃，GPC有专用柱良好的色谱实验习惯拿到一根新色谱柱时，先测柱效保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件定期检测柱效色谱柱的使用及操作流动相的转换特别是GPC柱流速(压力)的变化幅度温度的变化幅度专用色谱柱∶样品及溶剂的要求色谱柱的保养〔一〕样品方面除去微粒及杂质了解样品在流动相中的溶解度如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用色谱柱的保养〔二〕流动相方面除去微粒纯度的要求超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低缓冲液的pH值，在填料的允许范围内缓冲液〔盐〕的浓度溶剂：色谱纯，并与填料相匹配溶剂中的杂质含量流动相对样品的溶解度有机溶剂或水的比例在线的保护装置给色谱柱提供物理的保护除去样品及流动相中的颗粒给色谱柱提供化学的保护防止分析柱被化学污染装置在线过滤器自装填料保护柱预装保护柱在线过滤器在线过滤器防止颗粒在色谱柱头累积优点：基本不影响柱效在需要高柱效的分析时中常用〔如：氨基酸分析〕可更换的消耗品更换滤芯更换垫圈保护柱可避免化学污染。多数保护柱影响到整个色谱柱的柱效，特别是在用微柱时保护柱的种类普通自装填料的保护柱用户自装填料影响柱效同装填技术有关，柱效降低较大OnGuard预装保护柱有各种填料的预装柱供选择，使用方便。填料容积较小，也引起柱效降低新型的保护柱适应的用户类型非常脏,非常复杂的样品本底生化样品,溶液环境样品食品不想作太多的固相萃取不想降低柱效新型的保护柱特点高质量,高效填料-不损失柱效增加分析柱效-增加适应范围20mm柱长-脏样品载荷能力大，能延长保护柱寿命手可拧紧接头，安装时不需要工具通用柱套-适用于所有的HPLC柱及内径)整体式-使用方便，容易各种不同填料配合色谱柱色谱柱的清洗对所做的样品要有充分的了解用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗硅胶柱的一般方法先用甲醇洗去极性杂质用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化键合相柱(烷基)的一般方法20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗

柱子尺寸柱子体积冲洗体积150x4.6mm2.5ml50ml200x4.6mm3.3ml65ml250x4.6mm4.2ml80ml色谱柱的存放存放前的处理除去杂质、盐合适的存放溶剂避免色谱柱床的干枯避免机械震动防止细菌生长注意存放的温度色谱柱常见毛病柱压过高多少才算高?不同色谱柱有差异不同系统有差异不同溶剂有差异柱效低重复性差不出峰，回收率低柱压过高为什么柱压会过高微粒堵塞样品流动相密封垫柱床膨胀不可逆吸附细菌生长柱效低为什