植物生理实验报告

本科学生综合性实验报告项目组长高铭远学号07070241011成员杜广宇、杜沙沙、段司宇、冯慧彬、宫亚坡专业生物技术班级1班实验项目名称小麦耐盐生理指标测定指导教师及职称开课学期2008至2009学年2学期上课时间2009年4月22日植物耐盐性生理指标的测定一、实验目的及要求通过本实验的学习，使学生掌握脯氨酸含量、过氧化物酶活性和丙二醛含量测定方法，掌握单因子方差分析，培养学生离心机和分光光度计的使用技能，为今后撰写毕业论文打下良好的基础。二、实验主要仪器和试剂仪器：离心机；分光光度计；恒温水浴锅试剂：酸性茚三酮溶液；冰醋酸；标准脯氨酸溶液；3%磺基水杨酸；过氧化物酶测定反应液；pH6.0磷酸缓冲液10%TCA；0.6%TBA三、实验原理植物在盐胁迫下,植物可通过积累一定量的脯氨酸降低水势，维持植物体内的水分平衡,保证植物的正常生长。脯氨酸本身是一种水溶性最大的氨基酸，，它可以防止原生质体的水分散失，在植物细胞生理干旱时，它的增加有助于细胞或组织保持水分。用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出脯氨酸的含量。植物在盐胁迫下，活性氧含量会明显增加，对植物体产生毒害，而过氧化物酶会清除植物体内多余的活性氧。过氧化物酶广泛存在于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶可以使愈创木酚氧化，产生茶褐色物质，在470nm处有最大吸收峰，可根据单位时间内A470的变化值，计算POD活性大小。植物在盐胁迫下，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛是其产物之一，通常将其作为脂质过氧化指标，用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。丙二醛（MDA）是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮），其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA-TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。四、实验步骤（一）实验材料的培养小麦种子吸胀8h后消毒、4°C下春化30天，采用砂培法种植，至三叶期，作为供试材料。（二）盐胁迫处理用100mmol/LNaCl对小麦进行盐胁迫，以未进行盐胁迫为对照，以进行盐胁迫为处理，盐胁迫3d后分别测定脯氨酸含量、过氧化物酶活性和丙二醛含量，对照和处理分别重复3次。（三）脯氨酸含量测定标准曲线的制作用100ug/ml脯氨酸配制成2、4、6、8、10ug/ml的标准溶液。取标准溶液各2ml,加2ml3%磺基水杨酸，2ml冰醋酸和4ml2.5%茚三酮试剂于具塞试管中，置沸水浴中显色1h，冷却后与波长520nm测定A值，以A值为纵坐标，脯氨酸浓度（ug/ml）为横坐标绘制标准曲线。脯氨酸的提取称取小麦叶片0.5g，加3%磺基水杨酸5ml研磨提取，匀浆移至试管中，在沸水浴中提取10min，冷却后，5000rpm离心20min，上清液即为脯氨酸粗提液。反应体系取上清液2ml，并加入1ml冰醋酸，2ml酸性茚三酮，混匀置于沸水浴中显色0.5h。以2ml磺基水杨酸，1ml冰醋酸，2ml酸性茚三酮为对照。在可见分光光度计下520nm处测得A值。脯氨酸的含量的计算从标准曲线查得脯氨酸浓度，计算出样品中脯氨酸的含量，以每克材料鲜重含脯氨酸的微克数表示（Ug/g）o（四）过氧化物酶活性的测定过氧化物酶的提取称取小麦叶片0.2g，加5mlpH6.0的磷酸缓冲液，再加入0.02gPVP-30（除去酚类物质的毒害，防止醍类物质的干扰）及少量石英砂研磨。4°C,5000rpm离心15分钟，上清液为酶粗提取液反应体系50Ul酶粗提取液加入4ml反应液，在可见分光光度计下470nm处测A值，放入后立即记时，每隔1min记一次数值，连续记录三次，取平均值。酶活力定义过氧化物酶活性以每克鲜重每分钟在470nm下A值的变化值，设每变化0.01A为一个酶活力单位。过氧化物酶活性=U/min・g（五）丙二醛含量测定丙二醛提取小麦叶片0.5g，加入10%三氯乙酸（TCA）5mL（分两次加）和少量石英砂充分研磨，匀浆液以5000r/min离心20min，上清液即为样品提取液。反应体系取2mL提取液，分别加入2mL0.6%TBA液，混匀，在试管上加盖塞，置于沸水浴中沸煮15min，迅速冷却，离心。取上清液测定532nm和450nm下的A值。以2mL水代替提取液调零。MDA含量计算：根据C=6.45XA532—0.56XA颗，计算出样品提取液中丙二醛的浓度C，然后再计算出每克样品中丙二醛的含量（训ol/g（FW）。五、实验结果标准液浓度（ug/ml）00.40.81.21.62.0

112O7,4O112O7,4O516O58•

O12O4O0.02-0匕111110。.511.5225脯氨酸浓度(us/ml)脯氨酸含量117.7393±7.393901a488.0333±231.259b原始数据：脯氨酸含量117.7393±7.393901a488.0333±231.259b对照处理A值含量或活性A值含量或活性（FW）（FW）脯氨酸1.0.0471.109.67191.0.1171.279.0875含量2.0.0512.119.35282.0.1872.448.50303.0.0533.124.19333.0.3063.736.5095POD1.A值1.A值活性0.448,0.569,0.684,0.7860.877，1.112，1.322，1.511差值0.121，0.115，0.1021.11266.67差值0.235，0.210，0.1891.21133.332.A值2.A值0.541，0.717,0.875，1.0211.112，1.389，1.622，1.807差值0.176，0.158，0.1462.16000差值0.277，0.233，0.1852.23166.673.A值3.A值0.701，0.880，1.046，1.1961.139，1.434，1.676，1.869差值0.179，0.166，0.1503.16500差值0.295，0.242，0.1933.24333.33丙二醛1.A450=0.408A532=0.1961.51.7861.A450=0.544A532=0.2021.49.913含量2.A450=0.397A532=0.1992.53.06152.A450=0.447A532=0.2012.52.30653.A450=0.443A532=0.2053.53.70853.A450=0.504A532=0.1863.45.873单因子方差分析结果：对^POD活性14588.89±2887.97a22877.78±1619.443b丙二醛含量52.852±0.978222a49.36417±3.251676a六、结果分析本次实验所得结果中，脯氨酸含量和POD活性测得结果差异显著，但丙二醛含量所测结果对照组与盐处理组差异并不十分明显，综合分析有以下原因：由于本次实验时间较长，前后相差一个月左右，致使三次测定中实验材料存在差异。麦苗所取部位不同，如叶部和茎部中脯氨酸含量、POD活性和丙二醛含量存在的差异可能影响实验结果。试验中，研磨不充分、石英砂和PVP加入不适量、每次水浴加热时间控制不精确等，都可能影响分光光度计测得结果，从而影响实验结果。由于测定丙二醛含量是，由多人测量，可能存在的误差较大，导致丙二醛含量两组差异不显著。实验中存在一系列的机械误差，也可能是影响实验结果。七、思考题：为什么使用砂培法培养实验材料？沙培介质的通气性较好，可以保证根际有较好的通气性。沙子的粒径较小，持水量较多，扩散范围大，根系能充分吸水吸肥，且根系水平方向伸展。每次都用新鲜营养液，较好的维持养分平衡，减少调控营养液的麻烦。持水量大，工业次数可减少，每天供液1—2次即可。水和肥料的用量较多，吸收利用率也不高，易于产生盐类积累。虽不易较精确控制，但仍可以调节PH。分光光度法要求A值在多大范围内，数据才可靠，如何调整？在实际分析工作中，溶液的吸光度控制在0.2〜0.7时