实时荧光定量PCR技术的原理及应用-胡忠课件

实时荧光定量PCR技术的原理及应用(RealtimeQuantitativePCR)实时荧光定量PCR技术的原理及应用1讲座提纲实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR医学和科研中的应用实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR医学和科研中的应用讲座提纲实时荧光定量PCR原理实时荧光定量2实时荧光定量PCR定义在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法实时荧光定量PCR定义在PCR反应体系中加入荧光基团3实时荧光定量PCR原理实时原理常规PCR技术：

对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析实时荧光定量PCR原理4实时荧光定量PCR原理定量原理介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析实时荧光定量PCR原理定量原理介绍5实时荧光定量PCR原理-----------扩增曲线扩增曲线图：

横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件实时荧光定量PCR原理-----------扩增曲线扩6实时荧光定量PCR原理-------荧光阈值荧光信号阈值（threshold）：

前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99真正的信号:荧光信号超过域值实时荧光定量PCR原理-------荧光阈值荧光信号阈7实时荧光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定义：

PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)value实时荧光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定义8实时荧光定量PCR原理-------Ct值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性实时荧光定量PCR原理-------Ct值的重现性横轴9实时荧光定量PCR原理---------定量原理理想的PCR反应：

X=X0*2n非理想的PCR反应：

X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率实时荧光定量PCR原理---------定量原理理想10实时荧光定量PCR原理---------定量原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0

(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:logM=logX0

(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:

logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量实时荧光定量PCR原理---------定量原理在扩11实时荧光定量PCR原理---------标准曲线模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量实时荧光定量PCR原理---------标准曲线12确定未知样品的C(t)值通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量Sample实时荧光定量PCR原理绝对定量25确定未知样品的C(t)值Sample实时荧光定量PCR原13讲座提纲实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用实时荧光定量PCR原理

实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用讲座提纲实时荧光定量PCR原理实时荧光定量14非特异性荧光标记：1、SYBRGreen特异性荧光标记：2、TaqMan3、MolecularBeacon4、Amplisensor实时荧光定量PCR原理---------DNA产物的荧光标记QQR非特异性荧光标记：实时荧光定量PCR原理-------15实时荧光定量PCR方法1---------SYBRGreen法SYBRGreen实时荧光定量PCR方法1---------SYBRG16SYBRGreen法工作机理SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBRGreenSYBRGreen法17实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI工18实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲线分析温度荧光强度TmTm值：DNA解链一半时的温度实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔19实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲线分析将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)-dIdTTm实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔20SYBRGreen法融解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产物SYBRGreen法21CyclenumberFlourescencCk102Ck104SampleCyclenumberLogofDNAconcentrationSYBRGreen法定量原理模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量CyclenumberFlourescencCk10222SYBRGreen法------------PCR反应的建立反应体系的建立及优化:SYBRGreen使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物反应Buffer体系的优化反应温度和时间参数:由酶和引物决定其他与常规PCR相同SYBRGreen法------------PC23天为时代公司利用SYBRGreen法定量检测样品DNA天为时代公司利用SYBRGreen法定量检测样品DNA24SYBRGreen法应用范围起始模板的测定基因型的分析融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。SYBRGreen法25SYBRGreen法优缺点对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA使用方便-----不必设计复杂探针非常灵敏便宜优点容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高缺点SYBRGreen法26与目标序列互补实时荧光定量PCR方法2-------TaqMan法TaqMan---水解型杂交探针5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针与目标序列互补实时荧光定量PCR方法2-------Ta27TaqMan法工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光TaqMan法28TaqMan法PCR反应的建立1、引物、探针的设计：

探针Tm为68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段<400bp，引物Tm为59-60℃2、反应参数的确定：

一般为：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）也可通过温度梯度优化退火温度72℃，45S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同TaqMan法29已肝病人血液中HBV的绝对定量目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测设置对照：浓度为106、105、104103的标准样品各一个，设阴性和空白对照实验步骤：提取HBVDNA设计特异引物设计TaqMan探针并标记探针扩增程序结果：获取血液样品中HBVDNA的精确copy数利用TaqMan法检测血液中的HBV已肝病人血液中HBV的绝对定量利用TaqMan法30数据分析分析结果：HBVDNA的精确copy数为3.7X105利用TaqMan法检测血液中的HBV数据分析分析结果：HBVDNA的精确copy数为3.7X31TaqMan法应用范围起始模板的定量基因型分析目的基因定量产物鉴定SNP分析TaqMan法32TaqMan法优缺点对目标序列的高特异性------阴性结果确定设计相对简单------与目标序列某一区域互补重复性比较好优点只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺点TaqMan法33实时荧光定量PCR方法3-------Molecularbeacon法(分子信标)标记荧光的发夹探针环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素淬灭剂发夹型杂交探针实时荧光定量PCR方法3-------Molecula34Molecularbeacon(分子信标)工作原理荧光共振能量转移（FRET）探针与DNA杂交时产生荧光-----变性过程：产生非特异性荧光-----延伸过程：不产生荧光------退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号Molecularbeacon(分子信标)工35Molecularbeacon(分子信标)应用范围起始模板的定量基因型分析产物鉴定SNP（单核苷酸多态性）分析Molecularbeacon(分子信标)36Molecularbeacon(分子信标)优缺点高特异性：对目标序列检测SNP最灵敏的试剂之一荧光背景低优点只能用于一个特定目标设计困难价格比较高缺点Molecularbeacon(分子信标)37讲座提纲实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍

实时荧光定量PCR实验设计及应用讲座提纲实时荧光定量PCR原理实时荧光定量38实时荧光定量PCR法标准样品相对定量中的内标内标通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA和体外转入的RNA实时荧光定量PCR法39实时荧光定量PCR法标准样品DNA拷贝数

用于生成标准曲线的样品如何设定？含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的cDNA紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释实时荧光定量PCR法标准样品DNA拷贝数用40实时荧光定量PCR法定量方法绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表达差异（不同时相）

2-△C（t）双标准曲线法实时荧光定量PCR法41实时荧光定量PCR法TaqMan法举例TaqMan法研究ERBB2在乳腺肿瘤组织标本中的表达差异实时荧光定量PCR法TaqMan法举例42TaqMan法举例标记探针使用TaqMan探针进行双通道荧光定量Fam标记目标基因探针VIC标记看家基因探针TaqMan法举例43TaqMan法举例材料准备从正常乳腺组织中提取的总RNA从乳腺癌组织中提取的总RNA含ERBB2andGAPDH的质粒用于生成标准曲线单双通道同时进行，独立分析ControlsnoRNA：阴性对照RNA+noreversetranscriptase：基因组对照TaqMan法举例44TaqMan法举例反应程序RT-qPCR反应程序：50ºC,30min95ºC,15min94ºC,15sec60ºC,1minplateread10ºC,foreverEnd35moretimesTaqMan法举例45TaqMan法举例癌症标记物表达Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2TaqMan法举例46TaqMan法举例实验结果单双通道相互验证A.MultiplexReactionsHealthyRNACarcinoma28.4826.4228.6826.9828.7826.9828.65±0.1526.80±0.32B.SingleplexreactionsHealthyRNACarcinoma28.6727.0928.7126.6828.7326.7028.70±0.0326.82±0.24TaqMan法举例实验结果单双通道相47TaqMan法举例实验结果定量Copiesng/µlTotalRNAHealthyRNATumorRNATumor/HealthyERBB210951052213024922.16XGAPDH95500857301360001308001.45XTaqMan法举例实验结果48TaqMan法举例实验结果定量分析ERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019HealthyRNATumorRNA0.01150.0180.018/0.011GraphCopiesng/µlTotalRNATaqMan法举例实验结果49TaqMan法举例实验结果表达差异HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpressionERBB2的表达差异TaqMan法举例实验结果50TaqMan法举例实验结果讨论通过RT-qPCR成功检测了ERBB2基因在不同组织的表达差异；在乳腺癌组织中，ERBB2的表达量是正常水平的1.8倍TaqMan法举例实验结果51实时荧光定量PCR法SYBRGreenI法举例利用SYBRGreen1进行GMO定量(SGI)forGMOsoydetection实时荧光定量PCR法SYBRGreen52SYBRGreenI法GMO概念转基因生物又称遗传修饰生物（GeneticallyModifiedOrganisms，GMO），是经基因工程技术改变基因组构成的生物，包括转基因植物、转基因微生物和转基因动物。SYBRGreenI法53SYBRGreenI法GMO概念1983年：首例转基因植物－转基因烟草1986年：转基因植物首次进入田间实验1994年：首例转基因植物产品－FlavrSavr延熟保鲜转基因番茄进入市场1996年－至今：转基因作物迅猛发展期SYBRGreenI法54SYBRGreenI法检测方法转基因生物包括了特异的核酸序列，调控序列、目标基因、报告基因通过内源基因来对每个样品DNA进行定量（Normalization)利用插入基因的定量来进行GMO含量检测SYBRGreenI法55SYBRGreenI法材料准备RoundupReady大豆（RTC公司，IRMM-41050-56）普通非转基因大豆从超级市场买来的下列食物用来作为测试样品： 大豆饼,豆制甜点和两个牌子的大豆粉SYBRGreenI法56SYBRGreenI法样品制备标准品的制备:转基因成分含量分别为0%,0.1%,0.5%,1%,2%和5%转基因大豆实验样本–从含大豆成分的样本中提取DNADNAfromStandard/SamplePCRmixGMOprimersTUBE1TUBE2PCRmixLectinprimersSYBRGreenI法57SYBRGreenI法引物设计Lectin扩增片段长度为318bp其引物为：正向：5’-GAC-GCT-ATT-GTG-ACC-TCC-TC-3’，反向：5’-GAA-AGT-GTC-AAG-CTT-AAC-AGC-GAC-G-3’EPSPS扩增片段长度为356bp其引物为：正向：5’-TGG-CGC-CCA-AAG-CTT-GCA-TGG-C-3’反向：5’-CCC-CAA-GTT-CCT-AAA-TCT-TCA-AGT-3’

SYBRGreenI法58SYBRGreenI法△C（t）定量

logA/B=logA-logB

A:EPSPSGMO

B:Lectinallbean

A/B:%GMO%GMO△C（t）

SYBRGreenI法59SYBRGreenI法测GMO数据收集与分析标准曲线log%GMO对应△C（t）获得熔解曲线分析，检测扩增产物数据处理：

C（t）EPSPS-C（t）lectin=△C（t）处理条件：假定两对引物有相同的扩增效率并且相互独立扩增。

SYBRGreenI法测GMO数据收集与分析60SYBRGreenI法测GMO熔解曲线分析Tm=~92oC熔解曲线–Lectin扩增

Tm=~88.5oC熔解曲线–epsps

扩增SYBRGreenI法测GMO61SYBRGreenI法测GMO实验结果1:标准曲线不同转基因成分含量与Ctepsps做标准曲线Cp4-epspsSYBRGreenI法测GMO实验结果1:标62SYBRGreenI法测GMO实验结果2:

样品的扩增曲线LectinepspsFoodSample#2FoodSample#1SYBRGreenI法测GMO实验结果2:样品的63SYBRGreenI法测GMO实验结果：

定量分析Standards/SampleC(t)epspsC(t)Lectin0ND22.60.1ND22.60.528.222.51.027.222.52.026.222.85.024.622.7SoyDessert24.622.4SoyFlourND22.2SoyBurger24.223.4SYBRGreenI法测GMO实验结果：定量64SYBRGreenI法测GMO实验结果

定量分析CalculateC(t)=C(t)

epsps–C(t)

lectinStandards/SampleC(t)epspsC(t)Lectin∆C(t)0ND22.6ND0.1ND22.6ND0.528.222.55.61.027.222.54.72.026.222.83.45.024.622.71.9SoyDessert24.622.42.1SoyFlourND22.2NDSoyBurger24.223.40.7SYBRGreenI法测GMO实验结果65SYBRGreenI法测GMO实验结果标准曲线生成y=-0.264x+1.202R2=0.998-0.40-0.200.000.200.400.600.800123456∆C(t)LogpercentGMO根据C(t)值与标准品百分含量做标准曲线SYBRGreenI法测GMO实验结果66SYBRGreenI法测GMO实验结果GMO定量

Standards/Sample∆C(t)%GMO0ND—0.1ND—0.55.6—1.04.7—2.03.4—5.01.9—SoyDessert2.14.40SoyFlourND<0.5SoyBurger0.7>5根据C(t)值标准曲线推算未知样本的转基因成分含量SYBRGreenI法测GMO实验结果GM67SYBRGreenI法测GMO实验结果讨论用于转基因成分定量生成标准曲线的样品如何设定？阳性材料与阴性材料按比例混合成为不同转基因百分含量的标准品分别提取DNA紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度，稀释至同一浓度SYBRGreenI法测GMO实验结果68SYBRGreenI法测GMO讨论

PCR扩增效率

看两个反应是否具有相同的扩增效率的方法是：cDNA样品在100倍浓度梯度稀释后扩增产物△CT如何变化斜率绝对值接近于0为保证上述假定成立，即ExA=ExB扩增子长度引物设计模板纯度、复杂度等反应条件SYBRGreenI法测GMO讨论69谢谢！谢谢！70实时荧光定量PCR技术的原理及应用(RealtimeQuantitativePCR)实时荧光定量PCR技术的原理及应用71讲座提纲实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR医学和科研中的应用实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR医学和科研中的应用讲座提纲实时荧光定量PCR原理实时荧光定量72实时荧光定量PCR定义在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法实时荧光定量PCR定义在PCR反应体系中加入荧光基团73实时荧光定量PCR原理实时原理常规PCR技术：

对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析实时荧光定量PCR原理74实时荧光定量PCR原理定量原理介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析实时荧光定量PCR原理定量原理介绍75实时荧光定量PCR原理-----------扩增曲线扩增曲线图：

横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件实时荧光定量PCR原理-----------扩增曲线扩76实时荧光定量PCR原理-------荧光阈值荧光信号阈值（threshold）：

前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99真正的信号:荧光信号超过域值实时荧光定量PCR原理-------荧光阈值荧光信号阈77实时荧光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定义：

PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)value实时荧光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定义78实时荧光定量PCR原理-------Ct值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性实时荧光定量PCR原理-------Ct值的重现性横轴79实时荧光定量PCR原理---------定量原理理想的PCR反应：

X=X0*2n非理想的PCR反应：

X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率实时荧光定量PCR原理---------定量原理理想80实时荧光定量PCR原理---------定量原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0

(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:logM=logX0

(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:

logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量实时荧光定量PCR原理---------定量原理在扩81实时荧光定量PCR原理---------标准曲线模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量实时荧光定量PCR原理---------标准曲线82确定未知样品的C(t)值通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量Sample实时荧光定量PCR原理绝对定量25确定未知样品的C(t)值Sample实时荧光定量PCR原83讲座提纲实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用实时荧光定量PCR原理

实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用讲座提纲实时荧光定量PCR原理实时荧光定量84非特异性荧光标记：1、SYBRGreen特异性荧光标记：2、TaqMan3、MolecularBeacon4、Amplisensor实时荧光定量PCR原理---------DNA产物的荧光标记QQR非特异性荧光标记：实时荧光定量PCR原理-------85实时荧光定量PCR方法1---------SYBRGreen法SYBRGreen实时荧光定量PCR方法1---------SYBRG86SYBRGreen法工作机理SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBRGreenSYBRGreen法87实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI工88实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲线分析温度荧光强度TmTm值：DNA解链一半时的温度实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔89实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲线分析将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)-dIdTTm实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔90SYBRGreen法融解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产物SYBRGreen法91CyclenumberFlourescencCk102Ck104SampleCyclenumberLogofDNAconcentrationSYBRGreen法定量原理模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量CyclenumberFlourescencCk10292SYBRGreen法------------PCR反应的建立反应体系的建立及优化:SYBRGreen使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物反应Buffer体系的优化反应温度和时间参数:由酶和引物决定其他与常规PCR相同SYBRGreen法------------PC93天为时代公司利用SYBRGreen法定量检测样品DNA天为时代公司利用SYBRGreen法定量检测样品DNA94SYBRGreen法应用范围起始模板的测定基因型的分析融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。SYBRGreen法95SYBRGreen法优缺点对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA使用方便-----不必设计复杂探针非常灵敏便宜优点容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高缺点SYBRGreen法96与目标序列互补实时荧光定量PCR方法2-------TaqMan法TaqMan---水解型杂交探针5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针与目标序列互补实时荧光定量PCR方法2-------Ta97TaqMan法工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光TaqMan法98TaqMan法PCR反应的建立1、引物、探针的设计：

探针Tm为68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段<400bp，引物Tm为59-60℃2、反应参数的确定：

一般为：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）也可通过温度梯度优化退火温度72℃，45S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同TaqMan法99已肝病人血液中HBV的绝对定量目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测设置对照：浓度为106、105、104103的标准样品各一个，设阴性和空白对照实验步骤：提取HBVDNA设计特异引物设计TaqMan探针并标记探针扩增程序结果：获取血液样品中HBVDNA的精确copy数利用TaqMan法检测血液中的HBV已肝病人血液中HBV的绝对定量利用TaqMan法100数据分析分析结果：HBVDNA的精确copy数为3.7X105利用TaqMan法检测血液中的HBV数据分析分析结果：HBVDNA的精确copy数为3.7X101TaqMan法应用范围起始模板的定量基因型分析目的基因定量产物鉴定SNP分析TaqMan法102TaqMan法优缺点对目标序列的高特异性------阴性结果确定设计相对简单------与目标序列某一区域互补重复性比较好优点只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺点TaqMan法103实时荧光定量PCR方法3-------Molecularbeacon法(分子信标)标记荧光的发夹探针环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素淬灭剂发夹型杂交探针实时荧光定量PCR方法3-------Molecula104Molecularbeacon(分子信标)工作原理荧光共振能量转移（FRET）探针与DNA杂交时产生荧光-----变性过程：产生非特异性荧光-----延伸过程：不产生荧光------退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号Molecularbeacon(分子信标)工105Molecularbeacon(分子信标)应用范围起始模板的定量基因型分析产物鉴定SNP（单核苷酸多态性）分析Molecularbeacon(分子信标)106Molecularbeacon(分子信标)优缺点高特异性：对目标序列检测SNP最灵敏的试剂之一荧光背景低优点只能用于一个特定目标设计困难价格比较高缺点Molecularbeacon(分子信标)107讲座提纲实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍

实时荧光定量PCR实验设计及应用讲座提纲实时荧光定量PCR原理实时荧光定量108实时荧光定量PCR法标准样品相对定量中的内标内标通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA和体外转入的RNA实时荧光定量PCR法109实时荧光定量PCR法标准样品DNA拷贝数

用于生成标准曲线的样品如何设定？含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的cDNA紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释实时荧光定量PCR法标准样品DNA拷贝数用110实时荧光定量PCR法定量方法绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表达差异（不同时相）

2-△C（t）双标准曲线法实时荧光定量PCR法111实时荧光定量PCR法TaqMan法举例TaqMan法研究ERBB2在乳腺肿瘤组织标本中的表达差异实时荧光定量PCR法TaqMan法举例112TaqMan法举例标记探针使用TaqMan探针进行双通道荧光定量Fam标记目标基因探针VIC标记看家基因探针TaqMan法举例113TaqMan法举例材料准备从正常乳腺组织中提取的总RNA从乳腺癌组织中提取的总RNA含ERBB2andGAPDH的质粒用于生成标准曲线单双通道同时进行，独立分析ControlsnoRNA：阴性对照RNA+noreversetranscriptase：基因组对照TaqMan法举例114TaqMan法举例反应程序RT-qPCR反应程序：50ºC,30min95ºC,15min94ºC,15sec60ºC,1minplateread10ºC,foreverEnd35moretimesTaqMan法举例115TaqMan法举例癌症标记物表达Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2TaqMan法举例116TaqMan法举例实验结果单双通道相互验证A.MultiplexReactionsHealthyRNACarcinoma28.4826.4228.6826.9828.7826.9828.65±0.1526.80±0.32B.SingleplexreactionsHealthyRNACarcinoma28.6727.0928.7126.6828.7326.7028.70±0.0326.82±0.24TaqMan法举例实验结果单双通道相117TaqMan法举例实验结果定量Copiesng/µlTotalRNAHealthyRNATumorRNATumor/HealthyERBB210951052213024922.16XGAPDH95500857301360001308001.45XTaqMan法举例实验结果118TaqMan法举例实验结果定量分析ERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019HealthyRNATumorRNA0.01150.0180.018/0.011GraphCopiesng/µlTotalRNATaqMan法举例实验结果119TaqMan法举例实验结果表达差异HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpressionERBB2的表达差异TaqMan法举例实验结果120TaqMan法举例实验结果讨论通过RT-qPCR成功检测了ERBB2基因在不同组织的表达差异；在乳腺癌组织中，ERBB2的表达量是正常水平的1.8倍TaqMan法举例实验结果121实时荧光定量PCR法SYBRGreenI法举例利用SYBRGreen1进行GMO定量(SGI)forGMOsoydetection实时荧光定量PCR法SYBRGreen122SYBRGreenI法GMO概念转基因生物又称遗传修饰生物（GeneticallyModifiedOrganisms，GMO），是经基因工程技术改变基因组构成的生物，包括转基因植物、转基因微生物和转基因动物。SYBRGreenI法123SYBRGreenI法GMO概念1983年：首例转基因植物－转基因烟草1986年：转基因植物首次进入田间实验1994年：首例转基因植物产品－FlavrSavr延熟保鲜转基因番茄进入市场1996年－至今：转基因作物迅猛发展期SYBRGreenI法124SYBRGreenI法检测方法转基因生物包括了特异的核酸序列，调控序列、目标基因、报告基因通过内源基因来对每个样品DNA进行定量（Normalization)利用插入基因的定量来进行GMO含量检测SYBRGreenI法125SYBRGreenI法材料准备RoundupReady大豆（RTC公司，IRMM-41050-56）普通非转基因大豆从超级市场买来的下列食物用来作为测试样品： 大豆饼,豆制甜点和两个牌子的大豆粉SYBRGreenI法126SYBRGreenI法样品制备标准品的制备:转基因成分含量分别为0%,0.1%,0.5%,1%,2%和5%转基因大豆实验样本–从含大豆成分的样本中提取DNADNAfromStandard/SamplePCRmixGMOprimersTUBE1TUBE2PCRmixLectinprimersSYBRGreenI法127SYBRGreenI法引物设计Lectin扩增片段长度为318bp其引物为：正向