细胞生物学课件：07 应元琳 IPS诱导多功能干细胞

诱导多能干细胞

iPSCs走进---临床八年1204班应元琳2014.1.3CompanyLogoiPSCs基本概念1.iPSC技术的建立2.目前存在的缺陷及改进3.应用前景4.CompanyLogo诱导多功能干细胞InducedPluripotentStemCells是一类自成体细胞（如皮肤细胞或血细胞）经过诱导因子处理后重编程而转化成的干细胞。像胚胎干细胞一样，iPS细胞几乎能够发育形成所有类型的细胞，是一类多能细胞。2006年日本京都大学山中伸弥（ShinyaYamanaka）领导的实验室在《CELL》上率先报道了iPS的研究CompanyLogo英国发育生物学家约翰·戈登(JohnGurdon)实现了终末分化期细胞核的重编程，成为证明细胞核全能性的关键证据,使细胞分化是通过对基因可逆性修饰而实现的观点得到普遍接受。2012年诺贝尔生理或医学奖

日本京都大学山中伸弥(ShinyaYamanaka)团队通过逆转录病毒将四种转化因子导入小鼠胚胎纤维母细胞中，并成功获得小鼠iPSC。次年，实现了人类细胞的重编程。CompanyLogo

iPSC技术的建立（以小鼠为例）Step4Step3Step2Step1iPSC干细胞特性的验证必需转化因子的确定Fbx15干细胞筛选系统的建立目标筛选因子检测范围的划定CompanyLogoStep1：目标筛选因子检测范围的划定大量文献证实了多种基因在ESC中特异性表达。于是通过筛选，Yamanaka研究团队将24种特异性基因划入检测范围内：早期胚胎及ESC中起到多分化潜能维持作用的基因Oct3/4,Sox2,NanogESC特殊表型长期维持基因及培养基中快速增殖所需基因Stat3,E-Ras,c-Myc,Klf4,β-catenin其他特异性表达基因，如Sox15CompanyLogoStep2：Fbx15干细胞筛选系统的建立通过共同源重组技术，在小鼠Fbx15基因处插入一段βgeo基因卡带，使基因敲入鼠的ESC对含G418的培养基具备抗性，而体细胞则因不能表达此抗性基因而无法在该培养基生存。此系统的建立为初步筛选出诱导成功的iPSC提供了条件CompanyLogoStep3：必需转化因子的确立将24种候选因子通过逆转录病毒全部转入基因敲入鼠的MEF内并将被转染细胞在含G418ESC培养基上培养,发现极少量细胞存活了下来，并呈现出ESC的圆形、大核、少质的细胞形态及近似ESC的细胞周期，因此这群细胞被命名iPS-MEF24然而，当研究团队将24种候选因子分别单独转入MEF时，抗G418阳性的细胞群落没有出现。这些结果证明，细胞核重编程的转化需要多个因子的共同参与，无法依赖单个因子完成.CompanyLogoStep3：必需转化因子的确立随后，分别将每个转化因子从24种候选因子中剔除，代之以余下种因子继续转染MEF，如果在10天内无法形成抗性细胞群，则认为该因子对G418细胞核重编程有潜在的诱导作用.实验证明，有10种因子符合上述要求，并且当这10种因子被共同转入MEF时可以达到24种因子共同转入时的同等效果。为进一步确定诱导细胞核重编程所需最少的转

化因子的组合，再一次通过剔除10种候选因子中的任一种来观察抗性细胞群的形成状况,确定了诱导MEF重编程的必需转化因子组合为Oct3/4,Sox2,c-Myc,Klf4CompanyLogoStep4：iPSC干细胞特性的验证分子上，通过反转录酶-聚合酶连锁反应技术检测iPS-MEF表达的ESC标志基因。细胞水平上，将Ips-MEF移植入裸鼠体内可成功分化成三胚层畸胎瘤，经免疫检测和RT-PCR技术检测，该畸胎瘤中包括有神经组织，软骨及柱状上皮细胞。这证明了iPSCs的全能性CompanyLogoiPS技术存在的缺陷及发展非整合型诱导直接转入mRNA整合录病毒介导的低效性致癌性免疫原性优：避免了对宿主基因的直接修改而使致癌率降低缺;除了仙台病毒介导型，大部分诱导成功率显著下降优：mRNA能够在细胞质中稳定存在并持续翻译表达较长时间;诱导成功率相对较高缺：修饰技术难度较高；具有高度试剂敏感性；要求密集的实验工序，难以得到广泛推广。CompanyLogoiPS细胞技术应用前景再生医学能否利用iPS细胞技术为心脏病患者进行心肌再生；能否利用iPS细胞技术帮助脊柱损伤的病人，以及其他患神经退行性疾病（如阿兹海默病、亨廷顿氏病和帕金森病）的病人。药物安全性利用iPS技术，UCSF的BruceConklin教授正在利用重编程人类成体细胞形成心脏细胞，将之用于药物研发过程的早期阶段的毒性试验，从而实现节省花费在昂贵的动物及人体试验上的时间与成本。个体化医学利用病人自身的细胞，研究者可以通过iPS细胞来生成具有病人DNA的大脑、心脏、肝脏等器官以及其他细胞。这些细胞然后可以被用于特定患者的药物反应试验，或者用于移植与再生。CompanyLogoReference/link?url=ia1AJ5S56C_R_fKesKT_EjT68PJ5hXhswSztatbdIFMS2FUnJiZmpGfgqioJUQ_5Jf97I14_9TedYO9tPEu-AK/experiment/430/488/501/2155