溶液各种配制

..附录：常用试剂配制及应用一、常用缓冲液、试剂的配制碳酸盐缓冲液<Carbonate-BicarbonateBuffer>由于碳酸盐pH值偏碱,因此,常用于pH>9的缓冲液配制〔附表1。附表1.0.2mol/L碳酸盐缓冲液〔pH9.2～10.7pH0.2mol/LNa2CO3<ml>0.2mol/LNaHCO3<ml>pH0.2mol/LNa2CO3<ml>0.2mol/LNaHCO3<ml>9.24.046.010.027.522.59.37.542.510.130.020.09.49.540.510.233.017.09.513.037.010.335.514.59.616.034.010.438.511.59.719.530.510.540.59.59.822.028.010.642.57.59.925.025.010.745.05.0磷酸缓冲液<PhosphateBuffers,PB>磷酸盐是使用最广泛的一种缓冲剂,由于它们是二级解离,有二个pKa值,所以用它们配制的缓冲液,pH范围最宽。NaH2PO4：pKa1＝2.12,pKa2＝7.21；Na2HPO4：pKa1＝7.21,pKa2＝12.32。另外,磷酸盐还有钾盐分子形式,一般来说,低温时钠盐难溶,钾盐易溶,因此,配制细胞培养用试剂时常常添加钾盐试剂,但若配制十二烷基硫酸钠〔SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时,只能用钠盐而不能用钾盐,因为SDS会与磷酸钾生成难溶的十二烷基硫酸钾。磷酸缓冲液的优点为：①可配制成不同离子强度的缓冲液；②适用pH缓冲范围较宽；③受温度影响缓冲液pH值变化较小；④离子强度对缓冲液pH影响较小,如0.1mol/L缓冲液稀释10倍其pH变化小于0.1。磷酸缓冲液的缺点是：①磷酸盐易与钙离子〔Ca2+、镁离子〔Mg2+及重金属离子结合生成不溶的沉淀物；②可能干扰某些生物化学反应过程,如对某些酶的催化活性具有一定程度的抑制作用。NaH2PO4的pH值偏酸性,可用作pH<4的缓冲液。Na2HPO4的pH值偏碱性,可用作pH>10的缓冲液。而pH＝6～8的中性缓冲液是更常用的缓冲液,需要NaH2PO4与Na2HPO4两种磷酸盐混合配制〔附表2。附表2.0.2mol/L磷酸盐缓冲液〔pH5.7～pH0.2mol/LNaH2PO4<ml>0.2mol/LNa2HPO4<ml>pH0.2mol/LNaH2PO4<ml>0.2mol/LNa2HPO4<ml>5.793.56.57.039.061.05.892.08.07.133.067.05.990.010.07.228.072.06.087.712.37.323.077.06.185.015.07.419.081.06.281.518.57.516.084.06.377.522.57.613.087.06.473.526.57.710.589.56.568.531.57.88.591.56.662.537.57.97.093.06.756.543.58.05.394.76.851.049.08.14.295.86.945.055.08.23.097.0磷酸盐缓冲溶液〔Phosphate-bufferedsaline,PBS>磷酸盐缓冲液是在磷酸缓冲液基础上添加NaCl以维持溶液的渗透压,因此,PBS适用于做细胞缓冲液,常用PBS配制如下。NaCl8gKCl0.2gNa2HPO41.44gKH2PO40.24g在800ml蒸馏水中溶解,用HCl调节溶液的pH值至7.2～7.4加水定容至1L,15psi〔1.05kg/cm2高压灭菌20min,室温保存备用。Tris缓冲液〔Tris-HClBuffer,TBTris的pH值偏于碱性,因此,通过添加HCl调节pH至所需值,Tris-HCl缓冲液的离子强度〔mol/L是专指Tris的浓度,如某一特定pH的0.05mol/LTris缓冲液的配制是将50ml0.1mol/LTris碱溶液与附表3所示相应体积〔ml的0.1mol/LHCl混合,加水至将体积100ml,即为0.05mol/LTris缓冲液。另外,按附表3制备的缓冲液,由于试剂来源的不同,缓冲液pH可能与所需略有差异,此时可通过稍许减少或增加HCl用量,精细调节pH至所需值。附表4.0.05pH需0.1mol/LHCl〔ml>pH需0.1mol/LHCl〔ml>7.145.78.126.27.244.78.222.97.343.48.319.17.442.08.417.27.540.38.514.77.638.58.612.47.736.68.710.37.834.58.88.57.932.08.97.08.029.2Tris盐缓冲液〔TBS：Tris盐缓冲液是在Tris缓冲液基础上添加NaCl以维持溶液的渗透压,因此,TBS也适用于做细胞缓冲液,常用TBS配制如下。8gNaCl、0.2gKCl以及3gTris溶解于800ml蒸馏水中,加入0.015g酚红并用HCl调pH至7.4用蒸馏水定容至1L,分装后在15psi〔1.05kg/cm2高压灭菌20min,室温保存。现在常用Tris盐缓冲液通常不加pH指示剂,而且该溶液如果不用于细胞培养,通常不加KCl及酚红。Hank’s液<Hank’sBalancedSaltSolution>Hank’s液是一种平衡盐溶液,主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗等。贮存液A液：<I>NaCl80gKCl4gMgSO4·7H2O1gMgCl2·6H2O1g用双蒸馏水定容至450ml。<II>CaCl21.4g<或CaCl2·2H2O1.85g>用双蒸馏水定容至50ml。将I和II液混合,即成A液。贮存液B液：Na2HPO4·12H2O1.52g,KH2PO40.6g,酚红0.2g,葡萄糖10.0g,酚红应先置研钵内磨细,然后按配方顺序一一溶解,用双蒸馏水定容至500ml。<3>应用液：A、B储存液分别经112.6℃湿热灭菌20min,取A和B液各25ml,加无菌双蒸馏水至450ml,使用前用无菌的3.5%或5.6%NaHCO3调至所需pH。注意：药品必须全部用A.R试剂,并按配方顺序加入,用适量双蒸水溶解,待前一种药品完全溶解后再加入后一种药品,最后补足水到总量。无Ca2+、Mg2+Hank’s液〔Hank’sSolutionwithoutcalcium,magnesiumsulfateNaCl80g,KCl4g,Na2HPO4·12H2O1.52g,KH2PO40.6g,葡萄糖10g,用双蒸馏水溶解后,加入0.4％酚红溶液50ml,再加入双蒸水至1000ml,112.6℃湿热灭菌20min,4℃冰箱保存。临用前将原液用无菌双蒸水作1：10倍稀释,用无菌的3.5%或5.6%NaHCO3调至所需pH。pH7.2柠檬酸盐缓冲液<CitrateBuffer>柠檬酸0.327g柠檬酸钠2.63g磷酸氢钠0.222葡萄糖0.00255mg蒸馏水加至100ml。pH3.3枸橼酸-磷酸盐缓冲液〔Citricacid-PhosphateBuffer>0.131mol/Lcitrateacid,0.066mol/LNa2HPO4,等量混合,调节pH至3.3。0.5mol/LEDTA,pH8.0EDTA·2H2O186.1gNaOH～20g将EDTA·2H2O加入800ml水中,在磁力搅拌器上剧烈搅拌。用NaOH调节pH至8.0,EDTA直到接近pH8.0才完全溶解,定容至1L。分装后高压蒸汽灭菌。0.4%酚红溶液取酚红0.4g置于研钵中逐滴加入1mol/LNaOH溶液11.28ml,边研磨边使酚红转变为钠盐溶于水中,加双蒸水至100ml,过滤后,4℃冰箱保存。醋酸钾〔PotassiumAcetate在60ml5mol/L醋酸钾溶液中,加入11.5ml冰醋酸和28.5ml水。该溶液用于碱性裂解。3mol/L醋酸钠〔SodiumAcetate,pH5.2和pH7.0在800ml水中溶解408.1g三水醋酸钠,用冰乙酸调pH至5.2或用稀释乙酸调pH至7.0,加双蒸水至1L。分装后高压灭菌。柠檬酸钠缓冲液<SodiumCitrateBuffer>柠檬酸钠1.8gHCl<1mol>4ml无水乙醇95ml先用100ml去离子水溶解柠檬酸钠,然后加入HCl和无水乙醇,再补充去离子水至总量200ml。饱合硫酸铵溶液<SaturatedAmmoniumSulfateSolution>取500ml双蒸馏水,加入约400克硫酸铵,水浴加热至70℃,磁力搅拌器充分搅拌,直到加入的硫酸铵不再溶解,以氨水〔也可用NaOH调pH7.2,室温保存。二、酶免疫检测常用试剂配制包被液<CoatingBuffer>〔pH9.5碳酸盐缓冲液Na2CO3·10H2O8.58gNaHCO35.8g溶于双蒸水至1000ml。封闭液<Confiningliquid>〔5%脱脂乳-PBS溶液,pH7.4脱脂乳50g加0.02mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液〔PBS至1000ml溶解。洗液<washingliquid>氯化钠8.0g磷酸二氢钾0.2g磷酸氢二钠〔12H2O2.9吐温-200.5ml加去离子水至1000ml溶解即可。终止液<stopbuffer>〔2mol/LH2SO4：21.7mlH2SO4加去离子水至200ml。缓冲甘油<glycerinebuffer>甘油9份PB〔pH8.01份将9份甘油与1份PB合并,充分混匀。0.5%H2O2-甲醇液<HydrogenPeroxide-MethanolSolution>〔总体积120ml3%H2O2 20ml甲醇 100mlDAB-H2O2底物缓冲液<DAB-H2O2SubstrateBuffer>取6mg二氨基联苯胺<3,3’-DiaminobenzidineTetrahydrochlorideDAB>溶解于10ml0.05molTris-HClpH7.6。使用前取0.3%H2O20.1ml加入到DAB溶液中<H2O2的终浓度为0.003%>。如有沉淀生成,则用滤纸过滤。5-溴-4-氯-3吲哚磷酸/四唑氮蓝底物显色液〔BCIP/NBTSubstrateSolution贮存液配制：NBT：在10ml70%的乙醇中溶解0.5gNBT。BCIP：在10ml100%二甲基甲酰胺中溶解0.5gBCIP。贮存液4℃保存,可稳定一年。底物显色液：取66μlNBT贮液与33μlBCIP加入到10ml碱性磷酸酶缓冲液中,充分混匀,底物显色液应在用前1小时内配制。三、细胞相关试剂配制L-谷氨酰胺〔L-G溶液〔L-glutaminSolution〔0.2mol/L称2.9gL-谷氨酰胺〔分子量为146.15用去离子水溶解至100ml,过滤除菌,分装小瓶,4～5ml/瓶,-20℃冻存。100x青-链霉素〔双抗溶液〔P/SPenicillin/StreptomycinSolution取青霉素G〔钠盐100万单位和链霉素〔硫酸盐1g,溶于100ml去离子水中,分装小瓶,4～5ml/瓶,-20℃冻存。7.5%NaHCO3溶液〔NaHCO3Solution称分析纯NaHCO37.5g,用去离子水溶解至l00ml,过滤除菌,分装小瓶,4～5m1/瓶,盖紧瓶塞,4℃保存。HEPES溶液〔HEPESSolution〔1mol/L称23.83gHEPES〔N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicacid,N-2-羟乙基呱嗪-N'-2-乙基磺酸,分子量为238.3,用去离子水溶解至100ml,过滤除菌,分装小瓶,4～5m1/瓶,4℃保存。氨基喋呤〔A贮存液〔AminopterinStockingSolution〔100×,4×10-5mol/L称1.76mg氨基喋呤〔Aminopterin,分子量440.4,溶于90m1去离子水中,滴加lmol/LNaOH0.5m1,并不断搅动,待氨基喋呤完全溶解后,加1mol/L的HCl0.5m1中和,再补加去离子水至100m1。过滤除菌,分装小瓶,2ml/瓶,-20℃冻存。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷贮存液〔HTStockingSolution〔100×,H:10-2mol/L;T:1.6×10-3mol/L称取136.lmg次黄嘌呤〔Hypoxanthine,分子量136.1和38.8mg胸腺嘧啶核苷〔Thymidine,分子量242.2,加去离子水至l00ml,置45～50℃水浴中使完全溶解,过滤除菌,分装小瓶,2m1/瓶,-20℃冻存。用前可置37℃加温助溶。HAT培养液培养液98ml,A贮存液1m1,HT贮存液lml。秋水仙素溶液〔colchicineSolution称取10mg秋水仙素,溶于100m1生理盐水中〔即为100μg/ml,过滤除菌后,分装小瓶,－20℃Alsever’s血细胞保存液〔Alsever’sSolution葡萄糖2.05g,柠橡酸钠0.8g,NaCl0.42g,蒸馏水l00ml。以上成分混匀后,微加温使其溶解后,用柠檬酸调节pH6.1,分装于三角瓶中<30～50ml/瓶>,113℃湿热灭菌15min,4℃保存备用。细胞冻存液<FreezingMedium>50%小牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO〔二甲基亚砜。0.025%胰蛋白酶－0.2%EDTA细胞消化液<Trypsin-EDTASolution>A:2.5%胰蛋白酶:胰蛋白酶2.5g磷酸缓冲盐溶液100ml过滤除菌保存。B:0.2%二乙胺四乙酸二钠〔EDTAEDTA0.2g双蒸馏水100ml高压灭菌保存。取A液1份,加B液99份,混匀,分装-20℃0.83%NH4CI溶液<AmmoniumChlorideSolution>NH4CI0.83gKHCO30.1gEDTA·2Na0.0037g蒸馏水加至100ml。Tris-NH4Cl溶液<Tris-AmmoniumChlorideSolution>NH4Cl3.735g/450ml双蒸水+Tris1.3g/50ml双蒸水〔pH7.65。细胞裂解液〔CellLysisSolution20mmol/LHEPES<pH7.5>150mmol/LNaCl1mmol/LEDTA10g/ml1mmol/LPMSF1%TritonX-1000.5%deoxicholate<sodiumsalt>0.1%SDS组织匀浆缓冲液〔HistolysisBuffer50mmol/LTris-HCl<pH7.5>150mmol/LNaCl1%NP401mmol/Lphenylmethylsulfonylfluoride4g/ml1g/ml细胞核裂解液<NuclearLysisBuffer>10mmol/LTris-HCl<pH8.0>150mmol/LNaCl10mmol/LEDTA蛋白酶K100µg/ml0.4%SDS〔最后加10mmol/L苯甲基磺酰氟〔PMSF在异丙醇中溶解PMSF至1.74mg/ml,即10mmol/L,分装后保存于-20℃,如果需要的话,可将储存液制备至17.4mg/闪烁液<ScintillationSolution>PPO<2,5-二苯基>5.0g、POPOP〔1,4-双－5－苯基0.5g溶于1000ml二甲苯中。也可将POPOP加入二甲苯,在37℃3H-TdR工作液〔wokingSolution按1:20的比例将浓度为1mCi/ml的3H－TdR用无血清的RPMI培养液稀释,终浓度为50µCi/ml。肝素溶液的配制：含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高,肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠,包装为约为0.56克/瓶,配制时,可将其溶于100ml三蒸水中,定容,过夜,然后过滤除菌,分装小瓶,保存温度为4℃。使用时,向100ml培养液中加入1ml〔精确可加入0.9ml即可。Ⅰ型胶原酶：0.1％Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大,不容易过滤,因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。用时提前一小时37℃复温即可.0.1%的I型胶原酶的配置,100mg的粉末状的I型胶原酶可以溶于100ml的DMEM/F12,0.22微米滤器过滤0.1%的I型胶原酶的配置,100mg的粉末状的I型胶原酶可以溶于100ml的DMEM/F12,0.22微米滤器过滤.四、染色液配制〔PreprationofStainingSolution苏木素液<HematoxylinSolution>：苏木素2.5g,乙醇25.0ml,钾明矾2.5g,氧化汞1.25g,冰乙酸20.0ml,蒸馏水500.0ml。配制方法是先将苏木素溶于乙醇中〔稍加热。将预先已溶解明矾的蒸馏水加入苏木素乙醇液中,使溶液尽快沸腾后,将火焰熄灭,慢慢加入氧化汞,防止溶液油溅出,再煮沸2min。将烧瓶立即浸入冷水中,当染液冷却后,加入醋酸,室温保存,用前过滤。伊红Y染色液<EosinYSolution>伊红Y0.5～1.0g,蒸馏水75ml,95%乙醇25ml,冰乙酸1～2滴。先取少许蒸馏水加入伊红,用玻棒将伊红研碎,再加入全部蒸馏水,溶解后加入乙醇。甲基绿染色液<MethylGreeenSolution>新购买的甲基绿需用氯仿处理去除甲基紫。方法是将2%甲基绿水溶液20ml倾入洁净分液漏斗,移去慢慢下沉带紫红色的氯仿,再加入新的氯仿10ml,如此反复更换氯仿,到无紫红色为止。该液作为贮存液,4℃保存。染色液：甲基绿贮存液5ml,5%派诺宁水溶液1ml,蒸馏水12ml,0.2mol/L乙酸钠<pH4.8>18ml〔临用前配制,滤纸过滤。吖啶橙贮存液<AcridineOrangeStockingSolution>10mg吖啶橙溶解于100mlPBS中,pH4.8～6.0滤过,4℃避光保存。吉姆萨贮存液<GiemsaSolution>吉姆萨染色粉1g先溶于少量甘油,在研钵内研磨30min以上,至看不见颗粒为止,再将全部<66ml>剩余甘油倒入,于56℃温箱内保温2h。然后再加入甲醇<66ml>,搅匀后保存于棕色瓶中。母液配制后放入冰箱可长期保存,一般刚配制的母液染色效果欠佳,保存时间越长越好。临用时用pH7.4磷酸缓冲液稀释10倍,随配随用。瑞氏染色液<Wright’sSolution>瑞氏染色粉0.3g甘油3ml甲醇97ml将瑞氏染色粉放干燥研钵内磨细,加入甘油继续研磨,不断滴加甲醇并继续研磨,将上层溶解的染料倒入棕色瓶中,直至染料全溶后加甲醇至所需量。混匀后置棕色瓶中保存,用前过滤。一般配制后置室温一周便可使用,保存时间愈入,则染色效果愈佳。吉姆萨-瑞氏染色液<Giemsa-Wright’sStainingSolution>瑞氏染色粉0.3g吉姆萨染色粉0.03g甲醇100ml将二种粉末置于研钵中磨细,再逐滴加入甲醇混匀后倒入棕色瓶中,塞紧瓶口并充分振荡。置室温溶解后使用。噻唑兰〔MTT称取250mgMTT,加50mlPBS〔0.01mol/L,pH7.4在磁力搅拌器上搅拌30min,用0.22m的微孔滤膜过滤除菌,分装,台酚蓝染色液<TrypanBlueSolution>A：台酚蓝染料1g蒸馏水100ml将染料置于研钵中边研磨边加入蒸馏水溶解。B：NaCl1.7g蒸馏水100ml临用前A、B液1：1混合,离心沉淀,取上清供染色用。混合后的染液存放过久,易形成沉淀,故应新鲜配制。染色时,取细胞悬液0.1ml加入新鲜配制的染色液一滴,室温下染5～10分钟,取一滴悬液于载波片上,加盖玻片,高倍镜下检查。死亡细胞膨大并染成浅蓝色,活细胞不着色,大小正常。五、固定剂<Fixatives>大多数神经激素、肽类物质为水溶性,在用于免疫细胞化学研究之前,常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同,因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此,在进行免疫细胞化学研究之前,很有必要了解所要研究的物质〔蛋白质或肽类的化学性质,并根据需要来选择适宜的固定剂〔或固定方法以及改进固定条件。目前,免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂,其中以甲醛类和戊二醛最为常用。4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液,pH7.3〔formaldehyde-PhasphateBuffer多聚甲醛40g0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛,置于三角烧瓶中,加入500～800ml0.1mol/L磷酸缓冲液〔PhosphateBuffer以下简称PB,加热至60℃左右,持续搅拌〔或磁力搅拌至完全溶解,通常需滴加少许1NNaOH才能使溶液清亮,最后补足0.1mol/L的PB于1000ml,充分混匀。该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究,最好是动物经灌注固定取材后,继续浸泡固定2～24h。另外,该固定剂较为温和,适于组织标本的较长期保存。4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠〔formaldehyde-SodiumPhosphate/SodiumHydroxideBufferA液：多聚甲醛40g蒸馏水400mlB液：Na2HPO4·2H2O16.88g蒸馏水300mlC液：NaOH3.86g蒸馏水200ml配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制〔方法同前,至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意,在溶解多聚甲醛时,要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后,将B液倒入C液中,混合后再加入A液,以1NNaOH或1NHCl将pH调至7.2～7.4,最后,补充双蒸水至1000ml充分混合,4℃冰箱保存备用。该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究,用于免疫电镜时,最好加入少量新鲜配制的戊二醛,使其终浓度为0.5%～1%。该固定剂较温和,适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中,4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。六、蛋白电泳相关试剂30％丙烯酰胺〔Acrylmide丙烯酰胺29gN,N’-亚甲双丙烯酰胺1g溶于60ml水中,加热至37℃溶解,补加水至终体积100ml。0.45µM滤器过滤除杂质考马斯亮蓝R-250染色液〔CoomassieStainingSolution1.称取1g考马斯亮蓝R-250,置于1L烧杯中。2.量取250ml的异丙醇加入上述烧杯中,搅拌溶解。3.加入100ml的冰醋酸,搅拌均匀。4.加入650ml的去离子水,搅拌均匀。5.用滤纸除去颗粒物质后,室温保存。考马斯亮蓝脱色液〔DestainingSolution量取下列溶液,置于1L烧杯中,充分混合后使用。醋酸100ml乙醇50mldH2O850ml1mol/L二硫苏糖醇贮存液〔DTTStockingSolution用20ml0.01mol/L乙酸钠溶液〔pH5.2溶解3.09gDTT,过滤除菌后分装成1ml小份贮存于－20℃0.1mol/LpH2.4甘氨酸-HCl缓冲液<Glycine-HClBuffer>称取固体甘氨酸<MW75.07>15.01克,用蒸馏水溶解后,加入0.2mol/LHCl648ml,然后定容成2000ml。2×SDS凝胶加样缓冲液<2×LoadingBuffer>100mmol/LTris.Cl〔pH6.8200mmol/L二硫苏糖醇〔DTT4%SDS〔电泳级0.2%溴酚蓝20%甘油不含二硫苏糖醇的2×SDS凝胶加样缓冲液可以保存于室温,临用前须从1mol/L二硫苏糖醇〔DTT贮存液现用现加于上述缓冲液。10%十二烷基硫酸钠〔SDS在900ml蒸馏水中溶解100g电泳级SDS,加热至68℃助溶,加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2,加水定容至1L,分装备用。SDS的微细晶粒易于扩散,因此称量时要戴面罩,称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS,10%SDS溶液无需灭菌。电转印缓冲液为<Semi-DryTransferBuffer>Tris3gGlycine14.4gSDS0.185g加入甲醇200ml,用去离子水调至1000ml。Tris-乙酸50×〔TAETris碱242冰乙酸57.1ml0.5mol/LEDTA<pH8.0>100ml蒸馏水定容至1L。Tris-硼酸5×〔TBETris碱54硼酸27.5g0.5mol/LEDTA<pH8.0>20ml蒸馏水定容至1L。TE缓冲液10×<pH7.4,7.6,8.0>1.量取下列溶液,置于1L烧杯中。1mol/LTris-HCl<pH7.4,7.6,8.0>100ml500mmol/LEDTA<pH8.0>20ml2.向烧杯中加入约800ml的去离子水,均匀混合。3.将溶液定容至1L后,高温高压灭菌。4.室温保存。Tris－甘氨酸缓冲液〔Tris-GlycineBuffer5×Tris15.1g甘氨酸〔电泳级94g10％SDS〔电泳级50ml蒸馏水定容至1L。七、淋巴细胞分离液聚蔗糖－泛影葡胺分层液<Ficoll-paqueGradientMixer>90g/L聚蔗糖15ml,加500g/L泛影葡胺10ml〔比重1.14>。90g/L聚蔗糖17.5ml,加500g/L泛影葡胺10ml〔比重1.13>。90g/L聚蔗糖20ml,加500g/L泛影葡胺10ml〔比重1.12>。90g/L聚蔗糖24ml,加500g/L泛影葡胺10ml<比重1.08>。Percoll配制<PreprationofPercoll>将一份10×PBS与9份Percoll贮存液混合,制成等渗Percoll悬液,此悬液被认为是100%Percoll,其密度为1.1294/ml。利用1×PBS或细胞培养液稀释100%Percoll,可获得适宜密度的细胞分层液,用于各种细胞的分离,其浓度与密度的关系如下：70%Percoll比重1.090g/ml60%Percoll比重1.077g/ml50%Percoll比重1.067g/ml40%Percoll比重1.056g/ml30%Percoll比重1.043g/ml20%Percoll比重1.037g/ml人外周血单个核细胞〔PBMC分离Ficoll分层液配制9％聚蔗糖〔Ficoll24份34％泛影葡胺〔Urografin10％混合,测比重为1.077～1.078,G5玻璃滤器过滤除菌。4℃八、其它试剂佐剂<Adjuvant>动物实验常用弗氏佐剂〔Freundadjuvant,其成分通常是羊毛脂1份、液体石腊油5份,羊毛脂与石腊油的比例,视需要可调整为1：2～9〔V/V,充分混合后即是不完全福氏佐剂,如果在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全弗氏佐剂。配制方法：将羊毛脂与石蜡油按比例置于容器内,超声波混匀,高压灭菌,4℃保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合,用振荡器混匀成乳状,也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨,均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液〔其中加卡介苗3～4mg/ml或不加,加完后再继续研磨成乳剂,滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。为避免损失抗原,亦可用一注射器装抗原液,另一注射器装佐剂,二者以聚乙烯塑料管连接,然后二者来回反复抽吸,约数十分钟后即能完全乳化。检查合格后即以其中一注射器作注射用。清洁液<CleaningSolution>配方1：重铬酸钾100g

蒸馏水200ml

浓硫酸800ml

将重铬酸钾加入蒸馏水中,使之自然溶解或水浴溶解,亦可在大坩埚中加热溶解,然后慢慢加入浓硫酸,边加边搅拌,见发热过剧则稍停,冷却后再继续加。此为强洗液。盛清洁液的容器要坚固,上加厚玻璃盖,操作时要穿橡皮围裙、长统胶靴、戴上眼镜和厚胶皮手套,以保安全。洗液一旦变绿,表示铬酸已经还原,失去了氧化能力,不宜再用。如将这样洗液加热,再加适量重铬酸钾,又可重新使用。配方2：重铬酸钾60g蒸馏水300ml浓硫酸460ml此为中等强度洗液。配方3：重铬酸钾100g蒸馏水750ml浓硫酸250ml此液为弱洗液,为棕红色。使用此液时,必须预先用热肥皂水将玻璃器皿洗净,经自来水冲洗,沥干然后才能浸入,否则该洗液很快失效。〔崔雪玲氨苄青霉素〔Ampicillin

在9ml蒸馏水中溶解1gAmpicillin粉末并定容至10ml,然后用0.22um微孔滤膜过滤除菌,分装成小份存于-20℃。青、链霉素溶液：所用纯净水〔双蒸水需要15磅高压20分钟灭菌。具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶,用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶,加5ml灭菌双蒸水,即每毫升各为20万单位。分装于－20℃保存。使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。3%酸性酒精溶液浓盐酸3ml95%酒精97ml中性红指示剂中性红0．04g95%乙醇28ml蒸馏水72ml中性红pH6.8—8,颜色由红变黄,常用浓度为0．04%淀粉水解试验用碘液<卢戈氏碘液>碘片1g

碘化钾

2g

蒸馏水

300ml

先将碘化钾溶解在少量水中,再将碘片溶解在碘化钾溶液中,待碘全溶后,加足水分即成。溴甲酚紫指示剂溴甲酚紫

0．04g

0．01mol/L

NaOH

7．4ml

蒸馏水92．6ml

溴甲酚紫pH5．2—6．8,颜色由黄变紫,常用浓度为0．04%。溴麝香草酚蓝指示剂溴麝香草酚蓝0．04g

0．01mol/L

NaOH

6．4ml

蒸馏水

93．6ml

溴麝香草酚蓝pH6．0—7．6,颜色由黄变蓝,常用浓度为0．04%。甲基红试剂甲基红<Methyl

red>

0．04g

95%酒精

60ml

蒸馏水

40ml

先将甲基红溶于95%酒精中,然后加入蒸馏水即可。V．P．试剂1．5%α-萘酚无水酒精溶液α-萘酚5g无水乙醇100ml2．40%KOH溶液KOH40g蒸馏水100ml吲哚试剂对二甲基氨基苯甲醛2g95%乙醇190ml浓盐酸40ml格里斯氏<Griess>试剂A液：对氨基苯磺酸0．5g10%稀醋酸150mlB液：α-萘胺0．1g蒸馏水20ml10%稀醋酸150ml二苯胺试剂二苯胺0．5g溶于100ml浓硫酸中,用20ml蒸馏水稀释十一、阿氏<Alsever>血液保存液柠檬酸三钠·2H2O8g柠檬酸0．5g无水葡萄糖18．7gNaCl4．2g蒸馏水1000ml将各成分溶解于蒸馏水后,用滤纸过滤,分装,0．56—0．70kg/cm2<8—10磅/英寸2>,灭菌20分钟。冰箱保存备用。pH8．6离子强度0．075mol/L巴比妥缓冲液巴比妥2．76g巴比妥钠15．45g蒸馏水1000ml1%离子琼脂琼脂粉1g巴比妥缓冲液50ml蒸馏水50ml1%硫柳汞1滴称取琼脂粉1g先加至50ml蒸馏水中,于沸水浴中加热溶解,然后加入50ml巴比妥缓冲液,再滴加1滴1%硫柳汞溶液防腐,分装试管内,放冰箱中备用。电泳缓冲液50×Tris-乙酸〔TAE缓冲液成分及终浓度配制1L溶液各成分的用量2mol/L

Tris碱1mol/L

乙酸100

mmol/L

EDTA

水

242g

57.1

ml的冰乙酸〔17.4

mol/L200ml的0.5

mol/L

EDTA〔pH

8.0补足1L

1％溴酚蓝加1g水溶性钠型溴酚蓝于100ml水中,搅拌或涡旋混合直到完全溶解。1％二甲苯青FF〔xylenecyanoleFF溶解1g二甲苯青FF于足量水中,定容到100ml。10mg/ml的溴化乙锭小心称取1g溴化乙锭,转移到广口瓶中,加100ml水,用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解。用铝箔包裹装液管,于4℃贮存。四常用抗生素氨苄青霉素〔ampicillin〔100mg/ml溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中,最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。羧苄青霉素〔carbenicillin〔50mg/ml溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中,最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。甲氧西林〔methicillin〔100mg/ml溶解1g甲氧西林钠于足量的水中,最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。卡那霉素〔kanamycin〔10mg/ml溶解100mg卡那霉素于足量的水中,最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基氯霉素〔chloramphenicol〔25mg/ml溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中,最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。链霉素〔streptomycin〔50mg/ml溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中,最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。萘啶酮酸〔nalidixicacid〔5mg/ml溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中,最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。四环素〔tetracyyline〔10mg/ml溶解100mg四环素盐酸盐于足量的水中,或者将无碱的四环素溶于无水乙醇,定容至10ml。分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光,于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基五、常用贮存液的配制1．30%丙烯酰胺溶液[配制方法]将29g丙烯酰胺和1gN,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。加热至37℃溶解之,补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器〔0.45μm孔径过滤除菌,查证该溶液的pH值应不大于7.0,置棕色瓶中保存于室温。[注意]丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收,其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为它还可能会含有少量未聚合材料。一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子,在丙烯酰胺贮存液中加入大约0.2体积的单床混合树脂〔MB-1Mallinckrodt,搅拌过夜,然后用Whatman1号滤纸过滤以纯化之。在贮存期间,丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸。2．40%丙烯酰胺[配制方法]把380g丙烯酰胺〔DNA测序级和20gN,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为600ml的蒸馏水中。继续按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法处理,但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为1L。[注意]见上述配制30%丙烯酰胺的说明,40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列测定。3．放线菌素D溶液[配制方法]把20mg放线菌素D溶解于4ml100%乙醇中,1：10稀释贮存液,用100%乙醇作空白对照读取OD440值。放线菌素D〔分子量为1255纯品在水溶液中的摩尔消化系数为21,900,故而1mg/ml的放线菌素D溶液在440nm处的吸光值为0.182,放线菌素D的贮存液应放在包有箔片的试管中,保存于-20℃。[注意]放线菌素D是致畸剂和致癌剂,配制该溶液时必须戴手套并在通风橱内操作,而不能在开放在实验桌面上进行,谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤。药厂提供的作治疗用途的放线菌素D制品常含有糖或盐等添加剂。只要通过测量贮存液在440nm波长处的光吸收确定放线菌素D的浓度,这类制品便可用于抑制自身引导作用。4．0.1mol/L腺苷三磷酸〔ATP溶液[配制方法]在0.8ml水中溶解60mgATP,用0.1mol/LNaOH调至pH值至7.0,用蒸馏水定容1ml,分装成小份保存于-70℃5．10mol/L乙酸酰溶液[配制方法]把770g乙酸酰溶解于800ml水中,加水定容至1L后过滤除菌。6．10%过硫酸铵溶液[配制方法]把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中,该溶液可在4℃保存数周。7．BCIP溶液[配制方法]把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐〔BCIP溶解于10ml100%的二甲基甲酰胺中,保存于4℃8．2×BES缓冲盐溶液[配制方法]用总体积90ml的蒸馏水溶解1.07g盐溶液BES、1.6gNaCl和0.027gNa2HPO4,室温下用HCl调节该溶液的pH值至6.96、然后加入蒸馏水定容至100ml,用0.22μm滤器过滤除菌,分装成小份,保存于-20℃。9．1mol/LCaCl2溶液[配制方法]在200ml蒸馏水中溶解54gCaCl2•6H2O,用0.22μm滤器过滤除菌,分装成10ml小份贮存于-20℃。[注意]制备感受态细胞时,取出一小份解冻并用蒸馏水稀释至100ml,用Nalgene滤器〔0.45μm孔径过滤除菌,然后骤冷至0℃。10．2.5mol/LCaCl2溶液[配制方法]在20ml蒸馏水中溶解13.5gCaCl2•6H2O,用0.22μm滤器过滤除菌,分装成1ml小份贮存于-20℃。11．1mol/L二硫