海洋贝类腺体内五种游离生物激素的负化学源GCMS连续分析课件

海洋贝类腺体内五种游离生物激素的负化学源GCMS连续分析研究徐继林

严小军叶芳挺刘才才宁波大学浙江省海洋生物工程重点实验室

贵阳2004.9.23

海洋贝类腺体内五种游离生物激素的负化学源GCMS连续分析研究1目的意义目的意义2生物激素对生物体的生长发育和繁殖有着重要的生物学意义。对海洋贝类而言，主要有两类物质，一类是直接作用于相关受体的小分子物质包括肾上腺素（L-Epinephrine,EPI）、去甲肾上腺素（L-Norepinephrine,NEPI）和多巴胺（Dopamine,DOP）等；另一类是甾醇类激素如17β-雌二醇（17β-Estradiol,EST）和孕酮(Progesterone,PG)等，它们通过调控第一类物质的合成代谢和分泌对生物体起生殖调控作用。生物激素对生物体的生长发育和繁殖有着重要的生物学意义。3为了解它们在生物体内的合成代谢途径以及从环境中富集的程度大小，需要对它们在生物体内含量进行准确灵敏的测定。由于它们在生物体内含量很小，而研究过程中生物样品数量也很少，所以如果能够将它们通过一定的方法一次性测定出来将有很重要的现实意义。海洋贝类腺体内五种游离生物激素的负化学源GCMS连续分析课件4已经有大量生物体体液或组织中的激素测定报道，但大多是针对某种激素或是一类激素的研究，还未见将上述两类激素一次性连续测定的报道。已经有大量生物体体液或组织中的激素测定报道，但大多是针对某种5负离子化学（NegativeChemicalIon,NCI）源的气相色谱质谱联用（GC/MS）分析对具有强电子亲和力的化合物有着较高的灵敏度。本研究建立了NCI源气相色谱质谱联用检测海洋贝类腺体内5种激素的连续分析方法，以期为研究激素在贝类生物体内的调控作用提供方便灵敏的检测手段负离子化学（NegativeChemicalIon,6材料与方法

材料与方法7实验材料

实验试剂

激素标准品（纯度>98%，美国SIGMA-ALDRICH公司）；七氟丁酸酐（HeptafluorobutyricAnhydride,HFBA,）(美国Alltech公司）；乙酸乙酯（色谱纯，美国TEDIA公司）；其他试剂均为国产分析纯。实验材料实验试剂8实验材料

实验仪器

QP2010型GC-MS联用分析仪，带AOC-20自动进样器（日本SHIMADZU公司）；30m×0.25mm×0.25mSPB-1色谱柱（美国

SUPELCO公司）；固相萃取装置（美国

SUPELCO公司），C18固相萃取小柱（美国

SUPELCO公司），冷冻干燥机（韩国ILSHIN公司），超纯水仪（法国MILLIPORE公司）。另外，国产高速分散匀质机、旋转蒸发仪、旋涡混合仪、高速离心机、电子天平等。实验材料实验仪器9实验材料实验样品

2004年3月购自宁波市场的鲜活野生一龄曼氏无针乌贼（Sepiellamaindroni）和一龄野生褶牡蛎（Ostreaplicatula），解剖后取性腺，用高速分散匀质机匀浆后冷冻干燥备用。回收率实验采用缢蛏(Sinonvaculaconstricta)肌肉样品，高速分散匀质机匀浆冷冻干燥后备用。实验材料实验样品10标准溶液配制

20.0mg激素标准品酸性甲醇(0.1mol/LHCl)4.0mL

5mg/mL的标准贮备液

制作工作曲线时再取此储备液用甲醇配制成其他浓度的标准溶液。标准溶液配制20.0mg激素标准品酸性甲醇(0.1mo11样品预处理0.1g左右样品

0.5mL7mol/L的甲酸

涡旋震荡2min、超声抽提5min4000r／min离心5min上层液0.5mL7mol/L的甲酸重复抽提2次合并上层液1.5mL7mol/L氨水4000r／min离心5min上层液0.1mL/min

C18固相萃取柱

3mL去离子水淋洗

3mL80%丙酮水溶液洗脱

旋转蒸发

40℃水浴

干50LHFBA衍生剂

130℃油浴20min

氮气吹近干乙酸乙酯/醋酸酐定容

1:1(V/V)1.0mL

GC/MS分析样品预处理0.1g左右样品0.5mL7mol/L的12GC/MS定量定性分析1.分析条件GC条件：进样口温度250℃，载气为99.999%的高纯氦，总流速20mL/min,柱流速1.50mL/min,柱前压112.4kPa,柱起始温度100℃，保持3.5min，以20℃/min升至120℃后以2℃/min升至150℃，再以25℃/min升至280℃保持10min。不分流进样1L。GC/MS定量定性分析1.分析条件GC条件：进样口温度213GC/MS定量定性分析1.分析条件MS条件：采用NCI源分析，反应气为甲烷，离子源温度200℃，接口温度250℃，选取全程离子碎片扫描（SCAN）模式时，质量扫描范围为150~1000。选取特征离子碎片扫描（SIM）模式时，NEPI选择m/z541、953和213作为特征碎片离子；DOP选择m/z543、721和476作为特征碎片离子；EPI选择m/z770、558和213作为特征碎片离子；EST选择m/z644、428和197作为特征碎片离子；PG选择m/z490、470和178作为特征碎片离子；每组特征碎片离子中，前一个离子作为定量时的目标离子，后两个离子作为定性时的参考离子。GC/MS定量定性分析1.分析条件MS条件：采用NCI源14GC/MS定量定性分析2.定性分析

保留时间:相同的色谱条件下与标准色谱图进行对照，根据保留时间确定样品中激素类化合物GC/MS定量定性分析2.定性分析保留时间:相同的色谱15五种激素标准品衍生物在不同测定模式下的色谱图

五种激素标准品衍生物在不同测定模式下的色谱图16GC/MS定量定性分析2.定性分析

质谱图:GC/MS定量定性分析2.定性分析质谱图:175种激素的HFBI衍生物NCI源的质量谱图5种激素的HFBI衍生物NCI源的质量谱图18GC/MS定量定性分析3.定量分析

根据样品中所含各激素的特征离子信号响应强度，用外标法求出各激素的含量。。GC/MS定量定性分析3.定量分析根据样品中所19GC/MS定量定性分析4.回收率、精密度测定向0.1g未检出激素的缢蛏肌肉干样中分别加入激素各50ng，按照上述分析条件测定该样品中各激素的含量，平行测定三次。得方法的回收率和精密度。GC/MS定量定性分析4.回收率、精密度测定向0.1g未20结果结果21工作曲线

5种激素的线性方程

激素

Hormone

线性方程

Calibrationequation

回归系数

Regressioncoefficient

浓度范围（ng/mL）

Rangeofconcentration

NEPI

Y=653

X

0.9942

2.5~200.0

DOP

Y=564X

0.9993

2.5~200.0

EPI

Y=1035X

0.9955

2.5~200.0

EST

Y=1606X

0.9998

2.5~200.0

PG

Y=85

X

0.9999

2.5~200.0

工作曲线5种激素的线性方程激素Hormone22回收率和精密度

回收率和精密度23检测限

根据性噪比为3，用QP2010气相色谱-质谱分析仪随机所载SNRATIO软件，可计算出各标准物浓度为2.5ng/mL的信噪比，从而根据式MDL=3CN/S计算出仪器的检测限方法的检测限：检测限根据性噪比为3，用QP2010气相色245种激素的仪器检测限均小于1ng/mL5种激素的仪器检测限均小于1ng/mL25样品中激素的含量

取0.1g

左右曼氏无针乌贼和野生褶牡蛎的性腺按上述条件平行测定3次(表4)，各激素含量在未检出到17.92ng/g范围内。样品中激素的含量取0.1g左右曼氏无针乌贼和野生褶牡蛎26海洋贝类腺体内五种游离生物激素的负化学源GCMS连续分析课件27讨论讨论28衍生条件的选择由于各种激素分子上都带有两个以上的可衍生基团，所以在不同的温度条件下会有不同的衍生方式，而衍生时间又会影响衍生程度。

在过低的温度下过短的时间衍生往往不很充分选择130℃油浴20min过长时间过高温度条件又会带来较多的副产物而影响方法的灵敏度衍生条件的选择由于各种激素分子上都29五种激素标准品衍生物在不同测定模式下的色谱图

可见各衍生物都有良好的响应信号五种激素标准品衍生物在不同测定模式下的色谱图可见各衍生物都305种激素的HFBI衍生物NCI源的质量谱图5种激素的HFBI衍生物NCI源的质量谱图31Epinephrine,C9H13NO3,183.20

Norepinephrine,C8H11NO3,169.18

Dopamine,C8H11NO2,

153.18

Estradiol,C18H24O2,272.38.

Progesterone,C21H30O2,314.46

197HFBAEpinephrine,C9H13NO3,183.2032除NEPI出现了衍生物的分子离子信号（m/z953）外，其他激素衍生物的NCI-MS中均未出现分子离子信号，但都出现了[M-HF]-信号（DOP中的721、EPI中的947、EST中的644和PG中的490）,由此也可确定出在所确定的衍生条件下NEPI衍生上了4个7F基团，DOP衍生上了3个7F基团，EPI衍生上了4个7F基团，EST衍生上了2个7F基团，PG衍生上了1个7F基团。除NEPI出现了衍生物的分子离子信号（m/z953）外，其33提取、纯化条件的选择

提取：DOP、EST、PG最常的的提取溶剂为甲醇，但该研究对象为含脂肪含量很高的生物样品，而且NEPI和EPI均难溶解于大多有机溶剂

甲醇酸性水NEPI和EPI可以溶解于酸性水（pH<5），少量的DOP、EST和PG也可溶于酸性水（pH=1左右）中

兼顾两者，用有机酸7mol/L甲酸溶液（pH=1左右）

提取、纯化条件的选择提取：DOP、EST、PG最常的的提取34提取、纯化条件的选择纯化：NEPI、EPI和DOP这类儿茶酚胺类激素，可用WCX弱离子交换柱富集，再用甲酸洗脱得到良好的回收率（Zamecnik等，1997）。但实验表明固醇类激素在弱极性柱上保留效果不佳

固醇类激素，用C18柱富集，甲醇洗脱后再过硅胶柱，正己烷脱脂肪后用1:1二氯甲烷/乙酸乙酯洗脱（Casademont等，1996）。但实验表明这一类激素在硅胶柱上损失很大甲酸溶液提取，氨水中和离心可去除部分蛋白，样品过C18柱后用80%的丙酮水洗脱，可以尽量减少脂类物质的干扰，直接回收率在14.84-74.31%之间，与资料结果（Casademont等，1996）类似。。提取、纯化条件的选择纯化：NEPI、EPI和DOP这类儿茶酚35不足

本方法采用外标法进行定量分析

对于有着比较复杂前处理的定量分析，为了校正前处理中目标化合物的丢失，最好采用内标校正

。但由于几种化合物结构性质相差较大，很难找到一个合适的共同内标。国外同行均选择各激素的氢同位素内标，方法回收率可达75%-85%

（Zamecnik等，1997；Casademont等，1996

）所以如果也能采取各激素的同位素内标，一定也可以进一步提高方法的回收率不足本方法采用外标法进行定量分析对于有着比较复杂前36欢迎指教

谢谢！2004.9.23.欢迎指教2004.9.23.37海洋贝类腺体内五种游离生物激素的负化学源GCMS连续分析研究徐继林

严小军叶芳挺刘才才宁波大学浙江省海洋生物工程重点实验室

贵阳2004.9.23

海洋贝类腺体内五种游离生物激素的负化学源GCMS连续分析研究38目的意义目的意义39生物激素对生物体的生长发育和繁殖有着重要的生物学意义。对海洋贝类而言，主要有两类物质，一类是直接作用于相关受体的小分子物质包括肾上腺素（L-Epinephrine,EPI）、去甲肾上腺素（L-Norepinephrine,NEPI）和多巴胺（Dopamine,DOP）等；另一类是甾醇类激素如17β-雌二醇（17β-Estradiol,EST）和孕酮(Progesterone,PG)等，它们通过调控第一类物质的合成代谢和分泌对生物体起生殖调控作用。生物激素对生物体的生长发育和繁殖有着重要的生物学意义。40为了解它们在生物体内的合成代谢途径以及从环境中富集的程度大小，需要对它们在生物体内含量进行准确灵敏的测定。由于它们在生物体内含量很小，而研究过程中生物样品数量也很少，所以如果能够将它们通过一定的方法一次性测定出来将有很重要的现实意义。海洋贝类腺体内五种游离生物激素的负化学源GCMS连续分析课件41已经有大量生物体体液或组织中的激素测定报道，但大多是针对某种激素或是一类激素的研究，还未见将上述两类激素一次性连续测定的报道。已经有大量生物体体液或组织中的激素测定报道，但大多是针对某种42负离子化学（NegativeChemicalIon,NCI）源的气相色谱质谱联用（GC/MS）分析对具有强电子亲和力的化合物有着较高的灵敏度。本研究建立了NCI源气相色谱质谱联用检测海洋贝类腺体内5种激素的连续分析方法，以期为研究激素在贝类生物体内的调控作用提供方便灵敏的检测手段负离子化学（NegativeChemicalIon,43材料与方法

材料与方法44实验材料

实验试剂

激素标准品（纯度>98%，美国SIGMA-ALDRICH公司）；七氟丁酸酐（HeptafluorobutyricAnhydride,HFBA,）(美国Alltech公司）；乙酸乙酯（色谱纯，美国TEDIA公司）；其他试剂均为国产分析纯。实验材料实验试剂45实验材料

实验仪器

QP2010型GC-MS联用分析仪，带AOC-20自动进样器（日本SHIMADZU公司）；30m×0.25mm×0.25mSPB-1色谱柱（美国

SUPELCO公司）；固相萃取装置（美国

SUPELCO公司），C18固相萃取小柱（美国

SUPELCO公司），冷冻干燥机（韩国ILSHIN公司），超纯水仪（法国MILLIPORE公司）。另外，国产高速分散匀质机、旋转蒸发仪、旋涡混合仪、高速离心机、电子天平等。实验材料实验仪器46实验材料实验样品

2004年3月购自宁波市场的鲜活野生一龄曼氏无针乌贼（Sepiellamaindroni）和一龄野生褶牡蛎（Ostreaplicatula），解剖后取性腺，用高速分散匀质机匀浆后冷冻干燥备用。回收率实验采用缢蛏(Sinonvaculaconstricta)肌肉样品，高速分散匀质机匀浆冷冻干燥后备用。实验材料实验样品47标准溶液配制

20.0mg激素标准品酸性甲醇(0.1mol/LHCl)4.0mL

5mg/mL的标准贮备液

制作工作曲线时再取此储备液用甲醇配制成其他浓度的标准溶液。标准溶液配制20.0mg激素标准品酸性甲醇(0.1mo48样品预处理0.1g左右样品

0.5mL7mol/L的甲酸

涡旋震荡2min、超声抽提5min4000r／min离心5min上层液0.5mL7mol/L的甲酸重复抽提2次合并上层液1.5mL7mol/L氨水4000r／min离心5min上层液0.1mL/min

C18固相萃取柱

3mL去离子水淋洗

3mL80%丙酮水溶液洗脱

旋转蒸发

40℃水浴

干50LHFBA衍生剂

130℃油浴20min

氮气吹近干乙酸乙酯/醋酸酐定容

1:1(V/V)1.0mL

GC/MS分析样品预处理0.1g左右样品0.5mL7mol/L的49GC/MS定量定性分析1.分析条件GC条件：进样口温度250℃，载气为99.999%的高纯氦，总流速20mL/min,柱流速1.50mL/min,柱前压112.4kPa,柱起始温度100℃，保持3.5min，以20℃/min升至120℃后以2℃/min升至150℃，再以25℃/min升至280℃保持10min。不分流进样1L。GC/MS定量定性分析1.分析条件GC条件：进样口温度250GC/MS定量定性分析1.分析条件MS条件：采用NCI源分析，反应气为甲烷，离子源温度200℃，接口温度250℃，选取全程离子碎片扫描（SCAN）模式时，质量扫描范围为150~1000。选取特征离子碎片扫描（SIM）模式时，NEPI选择m/z541、953和213作为特征碎片离子；DOP选择m/z543、721和476作为特征碎片离子；EPI选择m/z770、558和213作为特征碎片离子；EST选择m/z644、428和197作为特征碎片离子；PG选择m/z490、470和178作为特征碎片离子；每组特征碎片离子中，前一个离子作为定量时的目标离子，后两个离子作为定性时的参考离子。GC/MS定量定性分析1.分析条件MS条件：采用NCI源51GC/MS定量定性分析2.定性分析

保留时间:相同的色谱条件下与标准色谱图进行对照，根据保留时间确定样品中激素类化合物GC/MS定量定性分析2.定性分析保留时间:相同的色谱52五种激素标准品衍生物在不同测定模式下的色谱图

五种激素标准品衍生物在不同测定模式下的色谱图53GC/MS定量定性分析2.定性分析

质谱图:GC/MS定量定性分析2.定性分析质谱图:545种激素的HFBI衍生物NCI源的质量谱图5种激素的HFBI衍生物NCI源的质量谱图55GC/MS定量定性分析3.定量分析

根据样品中所含各激素的特征离子信号响应强度，用外标法求出各激素的含量。。GC/MS定量定性分析3.定量分析根据样品中所56GC/MS定量定性分析4.回收率、精密度测定向0.1g未检出激素的缢蛏肌肉干样中分别加入激素各50ng，按照上述分析条件测定该样品中各激素的含量，平行测定三次。得方法的回收率和精密度。GC/MS定量定性分析4.回收率、精密度测定向0.1g未57结果结果58工作曲线

5种激素的线性方程

激素

Hormone

线性方程

Calibrationequation

回归系数

Regressioncoefficient

浓度范围（ng/mL）

Rangeofconcentration

NEPI

Y=653

X

0.9942

2.5~200.0

DOP

Y=564X

0.9993

2.5~200.0

EPI

Y=1035X

0.9955

2.5~200.0

EST

Y=1606X

0.9998

2.5~200.0

PG

Y=85

X

0.9999

2.5~200.0

工作曲线5种激素的线性方程激素Hormone59回收率和精密度

回收率和精密度60检测限

根据性噪比为3，用QP2010气相色谱-质谱分析仪随机所载SNRATIO软件，可计算出各标准物浓度为2.5ng/mL的信噪比，从而根据式MDL=3CN/S计算出仪器的检测限方法的检测限：检测限根据性噪比为3，用QP2010气相色615种激素的仪器检测限均小于1ng/mL5种激素的仪器检测限均小于1ng/mL62样品中激素的含量

取0.1g

左右曼氏无针乌贼和野生褶牡蛎的性腺按上述条件平行测定3次(表4)，各激素含量在未检出到17.92ng/g范围内。样品中激素的含量取0.1g左右曼氏无针乌贼和野生褶牡蛎63海洋贝类腺体内五种游离生物激素的负化学源GCMS连续分析课件64讨论讨论65衍生条件的选择由于各种激素分子上都带有两个以上的可衍生基团，所以在不同的温度条件下会有不同的衍生方式，而衍生时间又会影响衍生程度。

在过低的温度下过短的时间衍生往往不很充分选择130℃油浴20min过长时间过高温度条件又会带来较多的副产物而影响方法的灵敏度衍生条件的选择由于各种激素分子上都66五种激素标准品衍生物在不同测定模式下的色谱图

可见各衍生物都有良好的响应信号五种激素标准品衍生物在不同测定模式下的色谱图可见各衍生物都675种激素的HFBI衍生物NCI源的质量谱图5种激素的HFBI衍生物NCI源的质量谱图68Epinephrine,C9H13NO3,183.20

Norepinephrine,C8H11NO3,169.18

Dopamine,C8H11NO2,

153.18

Estradiol,C18H24O2,272.38.

Progesterone,C21H30O2,314.46

197HFBAEpinephrine,C9H13NO3,183.2069除NEPI出现了衍生物的分子离子信号（m/z953）外，其他激素衍