包含体复性课件

包含体的复性贾凌云基因工程产品目前的研发状况

目前基因表达的重组蛋白质已超过4000多种,其中用E.coli表达的要占90%以上,而这些蛋白质在E.coli中绝大多数是以包含体形式存在；用于临床的基因重组药物只占研发药物的约1%。存在的主要问题复性效率低：常用的复性方法—稀释和透析法的复性效率为5-20%；与杂蛋白分离困难，产品成本高。包含体形成的原因1.蛋白质高效表达的结果在载体系统中采用强的启动子和增强子序列,靶蛋白质表达分别可占细胞总蛋白的40%～50%，蛋白质的合成速度太快，肽链来不及折叠形成正确构象，导致分子间疏水基相互作用聚合而不溶。2.宿主内缺乏目标蛋白质正确折叠的辅助因子

对于大肠杆菌,来源于真核细胞的蛋白质是一种外界刺激因子,在进化过程中细菌细胞还没有形成与之完全相适应的结构基础和折叠机制,例如,处于还原环境的细菌胞质不能有效地完成二硫键蛋白质的氧化折叠;又如,辅助肽链折叠的分子伴侣和折叠酶的种类和功能不能完全适应较复杂真核蛋白质的折叠。如何使包含体复性？1，先用化学试剂将包含体溶解成为伸展的蛋白质一级结构；常用变性剂尿素、盐酸胍以及去污剂SDS等，可分别破坏蛋白质的高级结构及肽链之间的疏水作用，使其变成松散的水溶状态。2，使蛋白质的一级结构在合适的条件下重新折叠成正确的构象。UI1I2···IZ

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A聚集：是由暴露在溶剂中的疏水区相互作用的过程，速度快，一般在30秒内完成。复性：分子链内自我折叠的过程，相对缓慢，完全复性大约需10分钟的时间。蛋白质的重折叠机制1.用膜透析法或凝胶过滤去除变性剂，也可用稀释的方法，一般1-20mol/ml的低浓度条件下，重组蛋白的复性效果较好。对小分子的多肽，复性效率较高，对大分子蛋白和二硫键较多的分子，复性很困难。环糊精的分子结构

环糊精的疏水性空腔能够结合变性蛋白质多肽链的疏水性位点，可以抑制其相互聚集失活，从而促进肽链正确折叠为活性蛋白质。直链糊精基本上能够模拟环糊精在辅助蛋白质复性方面的作用，而且具有这样一些优点：直链糊精的螺旋结构形成一个疏水性空管，可以结合更多的蛋白质分子；在水中溶解度较高，有利于提高复性酶浓度和实验操作；价格比环糊精便宜，实际应用前景较好。直链糊精存在的问题：

分子伴侣在实际应用中尚存在费用高并需要与复性蛋白质分离等缺点，目前，分子伴侣还处于研究阶段，没有真正用于工业规模的包含体复性。蛋白质的色谱复性及其纯化液相色谱是纯化蛋白质的一个必不可少的手段。其原理是根据待分离物质与色谱固定相之间作用力的不同而得到分离。利用色谱复性正是利用了变性的蛋白质在色谱固定相上的吸附作用而避免了分子间的聚集作用，在吸附-脱附-吸附的过程中实现了蛋白质的复性。色谱法进行蛋白质复性的优点是:①在进样后可很快除去变性剂;②由于色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显地减少甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子聚集,从而避免了沉淀的产生,提高蛋白质复性的质量和活性回收率;③在蛋白质复性的同时可使目标蛋白质与杂蛋白分离以达到纯化的目的,使复性和纯化同时进行;④便于回收变性剂,以降低废水处理成本。

排阻色谱（SEC）复性机理:在变性蛋白进入柱顶端时,因有高浓度变性剂的存在,变性蛋白质分子有一个随机的构象状态和大的动力学水合半径,不能进入柱的空隙,蛋白质在柱上不保留。当使用复性的缓冲溶液洗脱时,因其逐步取代变性剂并使变性剂浓度降低,使变性蛋白质分子处于热力学不稳定的高能状态,这些蛋白质分子就会自发地向热力学稳定的低能态—即蛋白质的天然状态转化,从而使蛋白质开始复性。此时，局部复性的蛋白质可以进入球

的内部,开始在液固两相间进行分配,随着时间的推移,当蛋白质分子的结构变得更加紧密时,蛋白质在两相中的分配系数会逐步增加。当蛋白质进入柱填料的孔隙后,其扩散速度减缓,从而限制了蛋白质的聚集,这样就减少了沉淀的产生。蛋白质分子大,先从柱子上洗脱下来,变性剂分子质量小,最后流出色谱柱。故SEC的主要作用不是变性蛋白质与SEC固定相间的特殊作用力,而是有利于更换变性蛋白质复性的缓冲溶液,这里当然更不涉及二硫键是否正确对接的问题。与稀释法比较,该方法可使溶菌酶、碳酸酐酶和重组白细胞介素等的蛋白质质量回收率和活性回收率显著提高。

亲合色谱（AFC）复性机理：利用配体与目标蛋白质间的特异性亲和作用,使变性蛋白分子保留在柱的顶端使其与变性剂分离,而后在洗脱过程中进行复性的。按配基类型可分为:固定化金属亲和色谱脂质体亲和色谱分子伴侣亲和色谱脂质体作为配基对蛋白质复性的原理推测为:局部变性的蛋白质分子结构类似于融球状态,且具有与天然蛋白质相类似的二级结构,此时蛋白质分子仍然具有强的疏水表面,故可同脂质体的脂质双层作用以帮助蛋白质进行复性。例如：用脂质体色谱对失活的碳酸酐脱氢酶进行复性,其活性回收率为83%,如果使用没有脂质体的柱子,则回收率便降至58%;如果直接采用稀释50倍的方法,其活性回收率为52%。

疏水色谱（HIC）复性机理:当蛋白质、变性剂和杂蛋白质进入HIC系统后,由于HIC固定相对变性剂的作用力较弱,而对变性蛋白质的作用力较强,变性剂首先同变性的蛋白质分离,并随流动相一同流出色谱柱。又因HIC固定相能提供较通常方法高出数十乃至数百倍的能量,在变性蛋白质被HIC固定相吸附的同时瞬时除去以水合状态附着在蛋白质表面和与固定相表面接触区域的水分子,而蛋白质的特定的疏水性氨基酸残基与HIC固定相表面作用以形成区域立体结构(Micro-domain),接着形成折叠中间体(Intermediate),随着流动相的不断变化,变性蛋白质不断地在固定相表面上进行吸附-解吸附-再吸附,并在此过程中逐渐被复性,形成与天然蛋白质构象相同的蛋白质并流出色谱柱。在此过程中,因不同的蛋白质与固定,形成与天然蛋白质构象相同的蛋白质并流出色谱柱。在此过程中,因不同的蛋白质与固定相上的作用力强弱不同,复性的目标蛋白质就可以与大部分杂蛋白进行分离。利用HIC对E.coli表达的rhIFN