基因的重组与转移课件

基因的重组与转移课件1外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞第六章

基因的重组与转移

外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连2基因的重组与转移课件3一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。第一节DNA片段的体外连接一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-41.两段DNA的连接依靠粘性末端1.两段DNA的连接依靠粘性末端52.DNA片断与载体的连接依靠粘性末端2.DNA片断与载体的连接依靠粘性末端6基因的重组与转移课件7ligasenickligasenick8二、齐平末端（bluntend）的连接5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。1.直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’

3’

-OH-PP-HO-5’

3’

二、齐平末端（bluntend）的连接5’端与3’端并列靠91972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚加尾

法

2.人工加尾形成“粘性末端”

DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。②加尾—碱基互补1972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaise10④缺点：③优点：能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。非酶切位点④缺点：③优点：能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。11用T4DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（2）衔接物(linker)连接①linker用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用用T4DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个12

13

14④缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段2）能给载体连接上Polylinker:③优点：④缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也15（3）DNA接头(adapter)连接法1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’

BamHIadapter用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。①adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。②adapter的作用（3）DNA接头(adapter)连接法1978年康内尔大16Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’

5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’

接头自我连接Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH17基因的重组与转移课件18接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。③优点：连上后就能用。④缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我连接接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。195‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-PP-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’

接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’

5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’

CIP处理-OHHO-5‘p-GATCCCGG-OHP-CCGG-OH20Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P5‘GATCCCGG-HO-GGCCCCGG-OH-GGCCCTAG5’

5’GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC5’

缺口缺口HO--OHCIP处理T4ligase虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH21三、PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；（1）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构3’端15~20bp与模板互补；5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。（5’端多余的3~5bp属保护碱基）避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。三、PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点符合载体22引物1GCAGAATTC

互补序列模板EcoRI位点5’--3’

GCAGAATTC

互补序列5’--3’

3’

模板GCAGAATTC

互补序列PCR产物5’--3’

3’

复性延伸模板模板3’

3’

引物1GCAGAATTC互补序列模板EcoRI位点5’--23GCTAGCCGG

互补序列模板BamHI位点-5’

3-’

5’

复性延伸模板模板3’

3’

GCTAGCCGG

互补序列-5’

3’-模板5’

GCTAGCCGG

PCR产物

互补序列-5’

3’-引物2GCTAGCCGG互补序列模板BamHI位点-5’324带酶切位点的PCR产物GCAGAATTC

PCR产物5’--3’

GCTAGCCGG

PCR产物-5’

3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点BamHI位点AATTC

PCR产物5’--3’

GCTAG

PCR产物-5’

3’-GCEcoRIBamHI两头各有一个粘性末端！带酶切位点的PCR产物GCAGAATTCPCR产物5’--252.与T载体直接连接（1）PCR产物两个3’端一般都有一个ATaqDNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T利用TaqDNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！2.与T载体直接连接（1）PCR产物两个3’端一般都有一个26AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶载体PCR产物TATAAAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶载体PCR产物T27四、DNA体外连接应注意的事项插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。决不能进行非粘性末端连接。四、DNA体外连接应注意的事项插入片断与载体的酶切位点互补相28EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性末端。EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾292.DNA插入的方向正确（1）用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI2.DNA插入的方向正确（1）用双酶切由于产生的粘性末端不303.插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入（2）起始密码尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。ATGGAATTC载体ATGCGGAATTCT插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTCT重组但移码突变！3.插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入314.防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。5’

3’

载体插入片断4.防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量连接反应体321.载体自身环化连接（能存活）2.载体之间互相连接（能存活）3.插入片段互相连接（不能存活）4.一个载体与几个插入片段重组（能存活）五、载体和外源DNA插入片段的连接结果5.几个载体与一个插入片段重组（能存活）1.载体自身环化连接（能存活）2.载体之间互相连接（能存331717341.目的增加受体菌细胞膜的通透性。第二节

重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备1.目的增加受体菌细胞膜的通透性。第二节重组体导入细菌35使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。2.菌种使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。2.36基因的重组与转移课件37用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理384.制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃离心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的60mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重悬4.制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4Oni39二、重组DNA导入大肠杆菌（1）转化（transformation)大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（2）转染（transfection)大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。1.外源DNA导入细菌的几种方法（3）转导（transduction)借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。二、重组DNA导入大肠杆菌（1）转化（transformat40每gDNA转化成功的细菌克隆数。3.转化方法

2.转化率简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。（1）热休克法（heatshock）转化效率高（高于109/gDNA）。（2）电转化法每gDNA转化成功的细菌克隆数。3.转化方法2.4110ng载体DNA100L感受态菌Onice混合，静置10分钟42ºC1分钟加入1mLLB培养基37℃摇1小时10-100L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA（1）热休克法10ng载体DNA100L感受态菌Onice混合，静置42LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成50-300L

电转仪调为2.5kV,25F

脉冲控制器200-400

0.5g质粒DNA

Onice混合加入1mLSOC培养液37°C中速震荡60分钟10-100L转化液涂含抗菌素的平板转化（2）电转化法LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2°434.平板培养基培养细菌10-100L转化液涂于含抗菌素的平板37℃过夜4.平板培养基培养细菌10-100L转化液涂于含抗菌素的44环形重组质粒质粒自我连接线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。①环形质粒数（1）重组质粒

5.影响转化率的因素环形重组质粒线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。①环形质45①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。②必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。④储存感受态菌要在-70℃以下③CaCl2处理⑤使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。（2）感受态细胞

（competentcells)①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。②必须在冰冷的46把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。6.体外包装的噬菌体的转导（1）体外包装（invitropackaging）

（2）转导（transduction）通过受体菌细胞表面的DNA接受器位点（receptorsite)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染47cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保持溶源性。但当温度升高到44℃—45℃时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。（3）cI857基因突变的噬菌体

但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在3248cI857其它基因溶源状态（DNA不转录、不翻译）DNA阻遏蛋白阻遏蛋白44℃—45℃DNA转录、翻译合成外壳蛋白32℃cI857其它基因溶源状态（DNA不转录、不翻译）DNA49噬菌体1外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突变的噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。（4）

互补型噬菌体

外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。噬菌体2噬菌体1外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但50(5)体外包装过程

(5)体外包装过程51体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每gDNA能形成106噬菌斑）。（6）

转导

体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌52转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。第三节

外源基因导入真核细胞一、导入酵母细胞1.菌株选择如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31转化率高的菌株；第三节外源基因导入真核细胞一、导入酵母53（1）利用原生质球进行转化2.酵母的转化方法

酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母载体PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。

转化（1）利用原生质球进行转化2.酵母的转化方法酵母原生质54

酵母0.1mol/LLiCl处理插入外源基因的酵母载体感受态40%PEG4000（2）利用Li+盐进行转化酵母0.1mol/LLiCl处理插入外源基因的酵母载体感55叶盘消毒切取土壤农杆菌浸泡看护培养基愈伤组织分化幼苗二、导入植物细胞1.叶盘法（leafdisk)叶盘消毒切取土壤农杆菌浸泡看护培养基愈伤组织分化幼苗二、导入56植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液1-2kV,3-25F电击愈伤组织幼苗分化2.电击法（electroporation)植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液1-257又称高速微型子弹射击法（High-velocitymicroprojectiles)DNA1.2m钨弹头吸附特制手枪射击植物装入3.基因枪法（genegun）4.脓杆菌（agrobacterium）介导又称高速微型子弹射击法（High-velocitymicr58农杆菌:usedextensivelyforgeneticengineeringofplants.包含Ti质粒Tumorinducingplasmid(bacterialplasmid)T-DNA(Transferred-DNA),可以转移进入植物基因组.TumorinducedbyA.tumefaciens农杆菌（agrobacterium）农杆菌:usedextensivelyforgene59A、Ti质粒介导的整合转化程序

几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒Ti（Tumor-inducing）介导的。（1）Ti质粒的结构与功能A、Ti质粒介导的整合转化程序几乎所有的60TiPlasmidT-DNAregionLeftborderRightbordervirgenesori已知农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。T-DNA首先在细菌中被加工、剪切、复制，然后转入植物细胞。auxinTiPlasmidT-DNAregionLeftbor61Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为95～156×106D,约有200kb组成。根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以被分成四种类型：章鱼碱型(octopine)胭脂碱型(nopaline)农杆碱型（agropine）农杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型(succinamopine)Ti质粒的遗传特性及类型Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭62a、Ti质粒的图谱整个质粒160-240kb其中T-DNA12-24kbtms的编码产物负责：合成吲哚乙酸tmr的编码产物负责：合成植物分裂素tmt的编码产物负责：合成氨基酸衍生物冠瘿碱a、Ti质粒的图谱整个质粒160-240kb其中63b、Ti质粒致瘤的分子机制损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它们能诱导Ti质粒上的vir基因以及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达。vir基因产物将Ti质粒上的T-DNA单链切下，而根瘤菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA结合形成复合物，后者转化植物根部细胞。b、Ti质粒致瘤的分子机制损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸64c、T-DNA的染色体整合机制c、T-DNA的染色体整合机制65T-DNA的染色体整合机制T-DNA的染色体整合机制66d、Ti质粒的改造除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物；除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长；安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；安装植物细胞的筛选标记，如neor基因，使用植物基因的启动子和polyA化信号序列；安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。除去Ti质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度；d、Ti质粒的改造除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂67共整合转化程序共整合转化程序68二元整合转化程序将外源基因克隆在大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒的T-DNA区内；重组质粒直接转化农杆菌株，该菌株携带只含vir区不含T-DNA区的Ti辅助质粒；以上述重组农杆菌感染植物细胞。binaryTivectorsystem二元整合转化程序将外源基因克隆在大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒的T69B农杆菌介导的遗传转化：转化方法研究及宿主范围的拓展;转化机制研究;大片段的DNA转移;植株原位转化（inplantatransformation).B农杆菌介导的遗传转化：70转化方法研究及宿主范围的拓展

农杆菌有严格的宿主范围，它比较易浸染双子叶植物，对单子叶植物不敏感。但近年来有一定进展，农杆菌在一定条件下同样可以感染单子叶植物。利用农杆菌介导分别从水稻、小麦、玉米、甘蔗等获得了转基因植株。下面几个因素使农杆菌介导转化单子叶植物获得进展：使用酚类物质诱导vir基因表达。

首先发现AS（乙酰丁香酮）和HO-AS能诱导vir基因表达，后来发现邻苯二酚40多类酚类物质对virG有诱导活性。多种酚类复合物比单一酚类物质的诱导活性更高。此外，较低的pH、低于280C的温度、较高的渗透压、一些糖类等均能诱导vir基因表达。转化方法研究及宿主范围的拓展转化方法研究及宿主范围的拓展转化方法研究及宿主范围的拓展71广寄主范围农杆菌菌株的筛选。

主要是在农杆菌菌株的筛选、质粒载体的构建及菌株与载体的互作等方面进行了大量工作。使用单子叶植物特异启动子（如Actin,Ubiquione,andα-Amylase的启动子代替35S启动子）和利用分生组织与农杆菌共培养。

目前已清楚决定农杆菌与玉米的亲和性的是农杆菌的virA基因，对该基因进行改造可望提高农杆菌对单子叶植物的亲和性。生长和分裂旺盛的胚性愈伤组织被认为是获得单子叶植物转化成功的关键因素之一。广寄主范围农杆菌菌株的筛选。72转化机制研究

T-DNA整合进植物基因组的机制比较复杂，对其进行研究有助于建立转基因新方法。插入T-DNA区的基因本身与T-DNA的转移无关，仅两侧的25bp同向重复序列是必须的,而且右边界更重要。其中14bp是保守的。整合进植物基因组的T-DNA会有一定程度的缺失、重复、填充和超界发生，甚至有整个质粒整合进基因组的报道。T-DNA转移主要与vir区各基因的协调作用有关。转化机制研究T-DNA整合进植物基因组的机73基因的重组与转移课件74大片段DNA的转移通常转移的基因都是一个或几个功能基因，片段比较小（<30kb)。可是，植物的一些性状，如抗病、抗虫、抗逆境、高产优质等均为数量性状，或者相关的基因往往成簇排列。这些性状的改造需要一个能将大片段DNA转入植物细胞并稳定表达的体系。最近构建了一种新型载体，它具有细菌人工染色体（BACs)和农杆菌双元载体的特点，能转移大片段DNA。即BiBAC载体，目前在主要农作物的改良中应用还比较困难，但在水稻中可以有效应用。大片段DNA的转移通常转移的基因都是75功能基因组的研究要求创造很多突变体，需要寻求简单的转基因方法。主要在拟南芥中应用，大量的植株抽真空20分钟，使细菌进入植物细胞间隙，或者将花朵抽真空让细菌进入，这种方法避免了细胞培养过程，但转化效率不高。植株原位转化（inplantatransformation)功能基因组的研究要求创造很多突变体，需要寻求76SAAT:sonication-assistedAgrobacterium-mediatedtransformation

TransgenicResearch6,329-336.

超声波生物作用机制：

超声波的概念：频率高于人类听觉上限频率(约20000赫)的声波，称为超声波，或称超声。利用低声强脉冲超声波的物理作用，击穿细胞膜造成通道，使外源

DNA

进入细胞，直接转化细胞，包括有细胞壁的植物细胞。利用超声波给植物转化受体创造大量的，分布均匀的微小创口，提高农杆菌侵染效率。SAAT:sonication-assistedAgro77Fig.3.Crosssectionofcontrol(A)andSAAT-treated(BandC)immaturesoybeancotyledons.Bacteriaareindicatedbythearrows.TheepidermalcellsofthenonSAAT-treatedtissues(A)arestructurallyintactandbacteriacanbeseenonthesurface.InSAAT-treatedsamples,bacteriawereclearlyevidentinepidermalcells(B)andalsodeeperwithinthetissue(C)indicatingwoundingofbothsurfaceandsubsurfacetissue.Bar.50μm.Tricketal.1997SAAT:sonication-assistedAgrobacterium-mediatedtransformation

TransgenicResearch6,329-336.Fig.3.Crosssectionofcontr78

EfficientAgrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofsoybeansusinganembryonictipregenerationsystem,Planta(2004)219:1042–1049EfficientAgrobacteriumtume79（1）原理：三、导入哺乳动物细胞1.磷酸钙沉淀法HEPES缓冲盐水与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉淀。依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。（1）原理：三、导入哺乳动物细胞1.磷酸钙沉淀法HEPES80不需要载体。（2）特点：不需要载体。（2）特点：81脂质体有商业试剂盒（如LifeTechnologies）。2.脂质体（lipofectin）载体法脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。脂质体有商业试剂盒（如LifeTechnologies）。82直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。3.显微注射法(microinjection)直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。3.83二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。4.DEAE---葡萄糖传染法葡聚糖葡聚糖+DNA吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）84DEAE-dextran细胞外源DNA预处理摄入DEAE-dextran外源DNA细胞混合DEAE-dextran对细胞有毒!5.病毒（virus）介导（详见另外章节）DEAE-dextran细胞外源DNA预处理摄入DEAE-d85外源基因导入细胞的方法18外源基因导入细胞的方法1886演讲完毕，谢谢观看！演讲完毕，谢谢观看！87基因的重组与转移课件88外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞第六章

基因的重组与转移

外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连89基因的重组与转移课件90一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。第一节DNA片段的体外连接一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-911.两段DNA的连接依靠粘性末端1.两段DNA的连接依靠粘性末端922.DNA片断与载体的连接依靠粘性末端2.DNA片断与载体的连接依靠粘性末端93基因的重组与转移课件94ligasenickligasenick95二、齐平末端（bluntend）的连接5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。1.直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’

3’

-OH-PP-HO-5’

3’

二、齐平末端（bluntend）的连接5’端与3’端并列靠961972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚加尾

法

2.人工加尾形成“粘性末端”

DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。②加尾—碱基互补1972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaise97④缺点：③优点：能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。非酶切位点④缺点：③优点：能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。98用T4DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（2）衔接物(linker)连接①linker用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用用T4DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个99

100

101④缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段2）能给载体连接上Polylinker:③优点：④缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也102（3）DNA接头(adapter)连接法1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’

BamHIadapter用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。①adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。②adapter的作用（3）DNA接头(adapter)连接法1978年康内尔大103Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’

5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’

接头自我连接Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH104基因的重组与转移课件105接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。③优点：连上后就能用。④缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我连接接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。1065‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-PP-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’

接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’

5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’

CIP处理-OHHO-5‘p-GATCCCGG-OHP-CCGG-OH107Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P5‘GATCCCGG-HO-GGCCCCGG-OH-GGCCCTAG5’

5’GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC5’

缺口缺口HO--OHCIP处理T4ligase虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH108三、PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；（1）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构3’端15~20bp与模板互补；5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。（5’端多余的3~5bp属保护碱基）避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。三、PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点符合载体109引物1GCAGAATTC

互补序列模板EcoRI位点5’--3’

GCAGAATTC

互补序列5’--3’

3’

模板GCAGAATTC

互补序列PCR产物5’--3’

3’

复性延伸模板模板3’

3’

引物1GCAGAATTC互补序列模板EcoRI位点5’--110GCTAGCCGG

互补序列模板BamHI位点-5’

3-’

5’

复性延伸模板模板3’

3’

GCTAGCCGG

互补序列-5’

3’-模板5’

GCTAGCCGG

PCR产物

互补序列-5’

3’-引物2GCTAGCCGG互补序列模板BamHI位点-5’3111带酶切位点的PCR产物GCAGAATTC

PCR产物5’--3’

GCTAGCCGG

PCR产物-5’

3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点BamHI位点AATTC

PCR产物5’--3’

GCTAG

PCR产物-5’

3’-GCEcoRIBamHI两头各有一个粘性末端！带酶切位点的PCR产物GCAGAATTCPCR产物5’--1122.与T载体直接连接（1）PCR产物两个3’端一般都有一个ATaqDNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T利用TaqDNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！2.与T载体直接连接（1）PCR产物两个3’端一般都有一个113AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶载体PCR产物TATAAAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶载体PCR产物T114四、DNA体外连接应注意的事项插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。决不能进行非粘性末端连接。四、DNA体外连接应注意的事项插入片断与载体的酶切位点互补相115EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性末端。EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾1162.DNA插入的方向正确（1）用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI2.DNA插入的方向正确（1）用双酶切由于产生的粘性末端不1173.插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入（2）起始密码尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。ATGGAATTC载体ATGCGGAATTCT插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTCT重组但移码突变！3.插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入1184.防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。5’

3’

载体插入片断4.防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量连接反应体1191.载体自身环化连接（能存活）2.载体之间互相连接（能存活）3.插入片段互相连接（不能存活）4.一个载体与几个插入片段重组（能存活）五、载体和外源DNA插入片段的连接结果5.几个载体与一个插入片段重组（能存活）1.载体自身环化连接（能存活）2.载体之间互相连接（能存12017171211.目的增加受体菌细胞膜的通透性。第二节

重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备1.目的增加受体菌细胞膜的通透性。第二节重组体导入细菌122使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。2.菌种使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。2.123基因的重组与转移课件124用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理1254.制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃离心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的60mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重悬4.制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4Oni126二、重组DNA导入大肠杆菌（1）转化（transformation)大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（2）转染（transfection)大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。1.外源DNA导入细菌的几种方法（3）转导（transduction)借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。二、重组DNA导入大肠杆菌（1）转化（transformat127每gDNA转化成功的细菌克隆数。3.转化方法

2.转化率简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。（1）热休克法（heatshock）转化效率高（高于109/gDNA）。（2）电转化法每gDNA转化成功的细菌克隆数。3.转化方法2.12810ng载体DNA100L感受态菌Onice混合，静置10分钟42ºC1分钟加入1mLLB培养基37℃摇1小时10-100L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA（1）热休克法10ng载体DNA100L感受态菌Onice混合，静置129LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成50-300L

电转仪调为2.5kV,25F

脉冲控制器200-400

0.5g质粒DNA

Onice混合加入1mLSOC培养液37°C中速震荡60分钟10-100L转化液涂含抗菌素的平板转化（2）电转化法LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2°1304.平板培养基培养细菌10-100L转化液涂于含抗菌素的平板37℃过夜4.平板培养基培养细菌10-100L转化液涂于含抗菌素的131环形重组质粒质粒自我连接线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。①环形质粒数（1）重组质粒

5.影响转化率的因素环形重组质粒线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。①环形质132①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。②必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。④储存感受态菌要在-70℃以下③CaCl2处理⑤使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。（2）感受态细胞

（competentcells)①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。②必须在冰冷的133把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。6.体外包装的噬菌体的转导（1）体外包装（invitropackaging）

（2）转导（transduction）通过受体菌细胞表面的DNA接受器位点（receptorsite)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染134cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保持溶源性。但当温度升高到44℃—45℃时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。（3）cI857基因突变的噬菌体

但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32135cI857其它基因溶源状态（DNA不转录、不翻译）DNA阻遏蛋白阻遏蛋白44℃—45℃DNA转录、翻译合成外壳蛋白32℃cI857其它基因溶源状态（DNA不转录、不翻译）DNA136噬菌体1外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突变的噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。（4）

互补型噬菌体

外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。噬菌体2噬菌体1外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但137(5)体外包装过程

(5)体外包装过程138体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每gDNA能形成106噬菌斑）。（6）

转导

体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌139转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。第三节

外源基因导入真核细胞一、导入酵母细胞1.菌株选择如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31转化率高的菌株；第三节外源基因导入真核细胞一、导入酵母140（1）利用原生质球进行转化2.酵母的转化方法

酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母载体PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。

转化（1）利用原生质球进行转化2.酵母的转化方法酵母原生质141

酵母0.1mol/LLiCl处理插入外源基因的酵母载体感受态40%PEG4000（2）利用Li+盐进行转化酵母0.1mol/LLiCl处理插入外源基因的酵母载体感142叶盘消毒切取土壤农杆菌浸泡看护培养基愈伤组织分化幼苗二、导入植物细胞1.叶盘法（leafdisk)叶盘消毒切取土壤农杆菌浸泡看护培养基愈伤组织分化幼苗二、导入143植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液1-2kV,3-25F电击愈伤组织幼苗分化2.电击法（electroporation)植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液1-2144又称高速微型子弹射击法（High-velocitymicroprojectiles)DNA1.2m钨弹头吸附特制手枪射击植物装入3.基因枪法（genegun）4.脓杆菌（agrobacterium）介导又称高速微型子弹射击法（High-velocitymicr145农杆菌:usedextensivelyforgeneticengineeringofplants.包含Ti质粒Tumorinducingplasmid(bacterialplasmid)T-DNA(Transferred-DNA),可以转移进入植物基因组.TumorinducedbyA.tumefaciens农杆菌（agrobacterium）农杆菌:usedextensivelyforgene146A、Ti质粒介导的整合转化程序

几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒Ti（Tumor-inducing）介导的。（1）Ti质粒的结构与功能A、Ti质粒介导的整合转化程序几乎所有的147TiPlasmidT-DNAregionLeftborderRightbordervirgenesori已知农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。T-DNA首先在细菌中被加工、剪切、复制，然后转入植物细胞。auxinTiPlasmidT-DNAregionLeftbor148Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为95～156×106D,约有200kb组成。根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以被分成四种类型：章鱼碱型(octopine)胭脂碱型(nopaline)农杆碱型（agropine）农杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型(succinamopine)Ti质粒的遗传特性及类型Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭149a、Ti质粒的图谱整个质粒160-240kb其中T-DNA12-24kbtms的编码产物负责：合成吲哚乙酸tmr的编码产物负责：合成植物分裂素tmt的编码产物负责：合成氨基酸衍生物冠瘿碱a、Ti质粒的图谱整个质粒160-240kb其中150b、Ti质粒致瘤的分子机制损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它们能诱导Ti质粒上的vir基因以及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达。vir基因产物将Ti质粒上的T-DNA单链切下，而根瘤菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA结合形成复合物，后者转化植物根部细胞。b、Ti质粒致瘤的分子机制损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸151c、T-DNA的染色体整合机制c、T-DNA的染色体整合机制152T-DNA的染色体整合机制T-DNA的染色体整合机制153d、Ti质粒的改造除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物；除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长；安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；安装植物细胞的筛选标记，如neor基因，使用植物基因的启动子和polyA化信号序列；安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。除去Ti质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度；d、Ti质粒的改造除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂154共整合转化程序共整合转化程序155二元整合转化程序将外源基因克隆在大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒的T-DNA区内；重组质粒直接转化农杆菌株，该菌株携带只含vir区不含T-DNA区的Ti辅助质粒；以上述重组农杆菌感染植物细胞。binaryTivectorsystem二元整合转化程序将外源基因克隆在大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒的T156B农杆菌介导的遗传转化：转化方法研究及宿主范围的拓展;转化机制研究;大片段的DNA转移;植株原位转化（inplantatransformation).B农杆菌介导的遗传转化：157转化方法研究及宿主范围的拓展

农杆菌有严格的宿主范围，它比较易浸染双子叶植物，对单子叶植物不敏感。但近年来有一定进展，农杆菌在一定条件下同样可以感染单子叶植物。利用农杆菌介导分别从水稻、小麦、玉米、甘蔗等获得了转基因植株。下面几个因素使农杆菌介导转化单子叶植物获得进展：使用酚类物质诱导vir基因表达。

首先发现AS（乙酰丁香酮）和HO-AS能诱导vir基因表达，后来发现邻苯二酚40多类酚类物质对virG有诱导活性。多种酚类复合物比单一酚类物质的诱导活性更高。此外，较低的pH、低于280C的温度、较高的渗透压、一些糖类等均能诱导vir基因表达。转化方法研究及宿主范围的拓展转化方法研究及宿主范围的拓展转化方法研究及宿主范围的拓展158广寄主范围农杆菌菌株的筛选。

主要是在农杆菌菌株的筛选、质粒载体的构建及菌株与载体的互作等方面进行了大量工作。使用单子叶植物特异启动子（如Actin,Ubiquione,andα-Amylase的启动子代替35S启动子）和利用分生组织与农杆菌共培养。

目前已清楚决定农杆菌与玉米的亲和性的是农杆菌的virA基因，对该基因进行改造可望提高农杆菌对单子叶植物的亲和性。生长和分裂旺盛的胚性愈伤组织被认为是获得单子叶植物转化成功的关键因素之一。广寄主范围农杆菌菌株的筛选。159转化机