分子生物学：转录课件

第三章

生物信息的传递（上）

——从DNA到RNA1957年1970RNA除了某些RNA病毒之外，所有RNA分子都来自于DNA。基因组DNA通过一个被称为转录的过程把贮存在双链DNA分子中的遗传信息转换到与模板DNA链相互补的RNA单链上。mRNA，编码了一个或多个蛋白质序列；tRNA，把mRNA上的遗传信息变为多肽中的氨基酸信息；rRNA，是合成蛋白质的工厂核糖体中的主要成份。碱基的位置以起始位点为准，转录起始位点被定为+1，位于其下游的碱基序数按顺序值递增。起始位点前的一个碱基的位置被定义为-1，越靠近转录起始位点上游，碱基负值也越大。关于基因表达的两个基本问题RNA聚合酶如何找到DNA上的一个特异性启动子，而不和其它序列混淆？调控蛋白是如何与RNA聚合酶相互作用。从而增强或抑制转录的起始、延伸，或终止的？第一节信使的发现1955年Brachet用洋葱根尖和变形虫进行实验：若加入RNA酶，则蛋白质合成就停止；若再加入从酵母的RNA，又可合成蛋白质。这表明什么？同年Goldstein和Plaut用同位素标记变形虫RNA前体，发现标记的RNA在核内。标记追踪实验：经过一段时间发现被标记的RNA在细胞质中，

此表明什么？1956年E.Volkin和L.Astrachan，用同位素脉冲—追踪标记，表明T2噬菌体新合成的RNA的碱基比和它的DNA碱基比相似，而和细菌的碱基比不同。由于T2感染细菌时注入的是DNA，而在细胞里合成的是RNA，

此表明什么？最令人信服的证据是Hall.B.D和Spiegeman,S的DNA-RNA的杂交实验。将T2噬菌体感染E.coli后产生的RNA分离出来，分别与T2和E.coli的DNA进行分子杂交，结果这种RNA只能和T2的DNA形成“杂种”链，而不能和E.coli的DNA进行杂交。第二节RNA的酶促合成一.RNA合成的基本特点1960年Weiss,S,B等发现RNA聚合酶（RNAPol）。其特点是：（1）以核糖核苷三磷酸（rNTR）为底物；（2）以DNA为模板；（3）按5′-3′方向合成；（4）无需引物的存在能单独起始链的合成；（5）第一个引入的rNTP是以三磷酸形式存在；（6）在体内DNA双链中仅一条链作为模板；（7）RNA的序列和模板是互补的。E.coli在0C时需13秒钟才能加上一个核苷酸，但在37C每秒就可加上40个核苷酸;利用这个差别以14C来标记U,在0C培养E.coli。提取这种正在伸长的mRNA分子，发现14C标记首先出现在伸长的3′端，因此可以证明合成是延着5′-3′方向进行的。怎样用实验证实mRNA的合成总是延着5-3′方向进行的？二转录的基本过程模板识别(Templaterecognition)起始(Initiation)：流产起始（abortiveinitiation）在延伸(Elongation)阶段。终止(Termination)疏松结合位点(Loosebindingsite)第三节细菌基因的转录在细菌中一种RNA聚合酶负责所有mRNA、rRNA和tRNA的合成。一个E.coli细胞中约有7000个RNA聚合酶分子。它们中许多都参与转录；任意时刻大概有2000~5000酶在合成RNA(此数字因细菌的生长状态而异)。原核生物转录的起始延伸（一）启动子（promoter）的结构和转录起始(1)结构典型,都含识别（R),结合（B)和起始（I）位点;(2)序列保守;(3)位置和距离都比较恒定；(4)直接和多聚酶相结合；(5)常和操纵子相邻；(6)位于基因的5′端；(7)决定转录的启动和方向。典型启动子的结构-10序列是由Pribnow和Schaller（1975）发现，故也称为Pribnow框盒（Pribnowbox）。保守序列为T80A95T45A60A50T96位于-10bp左右，A.T较丰富，易于解链。其功能是:(1)RNApol紧密结合;(2)形成开放启动复合体；(3)使RNApol定向转录。典型启动子的结构－35序列又称为Sextama盒（Sextamabox），其保守序列为（T82T84G78A65C54A45）其功能是:(1)为RNApol的识别位点。σ亚基识别-35序列，为转录选择模板(2)-35和-10序列的距离是稳定的，此与RNApol的结构有关。典型启动子的结构转录起始位点（I）。起始位点通常(>90%)都是嘌呤碱基。起始位点经常作为CAT序列的中心，但是仅凭这个三联体的保守性还不足构成专有信号。σ因子的更替可控制转录起始包含不同σ因子的全酶在-35和-10区序列能够识别一系列不同的共有序列所携带的信息，暗示了什么？暗示了σ亚基一定在这些区域和DNA接触。这说明在σ因子和核心酶之间有一种通用的结合关系，使得σ因子可在-35和-10区域与启动子产生重要接触。大肠杆菌σ70的保守区

2.1和2.2区负责与核心酶的对接。

2.3区为熔化DNA链所必需，

2.4和4.2区与-10和-35启动子顺序结合。

N-端阻止2.4和4.2区在没有核心酶的时候与DNA的结合。原核生物转录的终止根据体外实验中RNA聚合酶是否需要辅助蛋白质参与终止，可将E.coli中的终止子分为两种类型：在体外，没有任何其它因子参与，核心酶也能在某些位点终止转录，这些位点被称为“内源性终止子(Intrinsicterminator)”。“ρ-依赖型终止子”（Rho-dependentterminator）：体外需要ρ因子的辅助；并且突变实验显示体内该因子参与了终止过程。---NNAAGCGCCGNNNCCGGCGCTTTTTTNNN------NNTTCGCGGCNNNGGCCGCGAAAAAANNN---…NNAAGCGCCGNNNCCGGCGCUUUUUUNNN…DNARNA内源性终止子一个二级结构中的发夹转录单位最末端的连续约6个U残基的区段ρ-依赖型终止子ρ因子如何行使功能ρ因子是E.coli的一种基本蛋白质，只在终止阶段发挥作用。由6个相同亚基组成，其分子量约275kD.亚基具有一个RNA结合域和ATP水解域。ρ因子是ATP依赖的六聚体解旋酶家族的一员。E.coli的ρ-依赖型终止子占所有终止子的一半左右ρ-依赖型终止作用所需的序列称为rut（rhoutilization)位点，位于终止子上游。它们的共同特征是RNA富含C残基而G残基很少。第四节真核生物的转录真核生物的转录和原核转录的不同点：(1)原核只有一种RNA聚合酶，而真核细胞有三种聚合酶；(2)启动子的结构特点不同，真核有三种不同的启动子和有关的元件；(3)真核的转录有很多蛋白质因子的介入。转录因子凡是转录起始过程必需的蛋白质，只要它不是RNA聚合酶的组成成分，就可将其定义为转录因子(transcriptionfactor，TF)。许多转录因子是通过识别DNA上的顺式作用位点而起作用的，然而结合DNA并不是转录因子的唯一作用方式；转录因子还可以通过识别另一种因子而起作用，或识别RNA聚合酶，或者只是和其他几种蛋白质一起组成转录起始复合体。一.真核的RNA聚合酶真核生物的启动子RNA聚合酶I和聚合酶Ⅱ的启动子基本上都位于转录起始点的上游，而部分RNA聚合酶Ⅲ的启动子可位于起始点下游。每种启动子均包含一组特征的短保守序列，能被相应的转录因子所识别。RNA聚合酶I和聚合酶Ⅲ各自识别一组相对严谨的启动子，并且只依靠了少数辅助因子。RNA聚合酶Ⅱ的启动子在序列上显示出更多的变化，并且具有模块结构。典型地，由RNA聚合酶Ⅱ所转录的基因应该有一个位于转录起始点上游的启动子。启动子含有几个短的能结合转录因子的序列元件(<10bp)，分布在超过200bp的范围内。增强子含有一簇更加紧密排列的可结合转录因子的元件，但可以位于距离转录起始点几个kb的位置上。(DNA可能的卷曲或重排，使得结合到启动子和增强子上的转录因子之间可以相互作用，从而形成一个大的蛋白质复合体。)启动子Ⅱ最为复杂，它和原核的启动子有很多不同：有多种元件：TATA框，GC框，CAAT框，OCT等；结构不恒定；它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同；有的有远距离的调控元件存在，如增强子；这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作用不直接和RNApol结合；需多种转录因子介入。RNA聚合酶II的转录起始RNA聚合酶II的转录起始纯化的RNA聚合酶Ⅱ能催化mRNA的合成，但不能起始转录，除非添加另外的抽提物，这个抽提物称为通用转录因子(generaltranscriptionfactor)：它们是一组任何启动子中RNA聚合酶Ⅱ起始转录所必需的蛋白质。RNA聚合酶Ⅱ与这些因子共同组成了基本转录装置(basaltranscriptionapparatus)，它是任何启动子的转录所需要的，这些通用因子称为TFIIX，其中“X”为不同的字母，用于区分各个因子。在真核生物中，RNA聚合酶Ⅱ的各个亚基和通用转录因子都是保守的。RNA聚合酶Ⅱ能够起始转录时所需的最短序列，称为核心启动子(corepromoter)。原则上，核心启动子在任何细胞中都可以启动表达，它所组成的最短序列应该能使通用转录因子在起始点上进行装配。它们参与DNA的结合和使RNA聚合酶Ⅱ起始转录的机制，但核心启动子的功能是极其低效的。另外需要一些称为激活剂的蛋白质来维持适当的功能水平。RNA聚合酶II的核心启动子起始点（initiator,Inr).一般没有同源序列，但mRNA的第一个碱基倾向A，其两侧为嘧啶（在原核CAT起始序列也有这种情况）。一般由Py2CAPy5构成,包含了-3～+5之间的区域。RNA聚合酶II的核心启动子TATA框合又称Hogness框，Goldberg-Hogness框，俚语称为金砖（Goldbrick）其一致序列是：T85A97T93A85A63A83A50常在-25左右，相当于原核的-10序列。其作用是：

(1)选择正确的转录起始位点，保证精确起始，故也称为选择子（selector）。

(2)影响转录的速率。RNA聚合酶II的核心启动子不含TATA元件的启动子称为无TATA启动子(TATA-lesspromoter)。对启动子序列的调查显示50％或更多的启动子可能没有TATA序列。当启动子不含TATA盒时，它通常会含有另一个位于+28位到+32位之间的元件，叫下游启动子元件(downstreampromoterelement,DPE）核心启动子会由TATA盒加上Inr组成，或者由DPE加上Inr组成。上游启动子元件（UPE）上游启动子元件（UPE）启动子的组成是可变的虽然为了有一定的转录起始效率必须存在一个或更多的上游元件，但没有一个上游元件对启动子功能是必不可少的。一些元件可以被多个因子所识别，任何一个特定的启动子使用哪一个因子可能由前后邻近序列上已结合的其他因子来决定。远端调控区增强子它是在1981年由Benerji,Rusconi小组和Chambom等发现。其特点是：具有远距离效应。无方向性。顺式调节。无物种和基因的特异性。具有组织的特异性。有相位性。其作用和DNA的构象有关。有的增强子可以对外部信号产生反应。在酵母中发现了类似于增强子的元件，称为上游激活子序列(Upstreamactivatorsequence，UAS)，它们能在正反两个方向上发挥作用，在启动子上游的不同距离处，但不能在下游发挥作用真核RNA聚合酶II启动子和增强子通过蛋白质的介导互相结合，形成环，启动转录(引自Griffithsetal1999)远端调控区绝缘子能阻断激活或失活效应通过的元件称为绝缘子(insulator)，它们有一种或同时有两种主要特性：当绝缘子置于增强子和启动子之间的时候，它能阻断增强子对启动子的激活作用。当绝缘子被置于一条活性基因和异染色质之间时，它能够提供一道屏障来保护基因防备异染色质延伸所带来的失活效应Ⅱ类基因的启动子和调控区

TATA框核心元件

启始子（initiator，Inr）:一般由Py2CAPy5构成，

位于-3～+5，可能提供RNApolⅡ识别。CAATbox、Ⅱ类启动子上游元件组成GCboxOct．增强子（enhancer）远端调控区沉默子（silencer）绝缘子（insulator）

上游激活序列（upstreamactivatingsequences,UASs）II类启动子上基本转录装置的装配对于含有TATA盒的启动子来说，形成转录复合体的第一步就是TFIID因子与TATA序列上游的一个区域相结合。TFIID含有2类组分：用来识别TATA盒的TATA结合蛋白(TATA-bindingprotein，TBP)，它约为30kDa；TFIID的另一个亚基称为TBP连接因子（TBP-associatedfactor,TAF）。含有不同TAF的TFIID能识别不同的启动子。稳定TFⅡD和DNA的结合，激活TBP亚基结合模板链（-10～+10），起始PolⅡ结合（提供一个识别表面，使聚合酶定向结合），和TFⅡE/F相互作用大亚基（RAP74）具解旋酶活性,小亚基（RAP38）和PolⅡ结合，介导其加入复合体结合在PolⅡ的前部，使复合体的保护区延伸到下游至＋30位使DNA上被保护的模板链位点延伸至＋15位II类启动子上基本转录装置的装配接下来两个因子TFIIH和TFIIJ跟在TFIIE后面加入到复合体中，但它们不改变复合体与DNA结合的模式。TFIIH是惟一具有独立酶活性的通用转录因子，它兼有几种酶活性，包括：ATP酶双向解旋酶和具有磷酸化RNA聚合酶Ⅱ的CTD尾部的激酶活性。TFIIH是另外一个可能在转录延伸中起作用的因子，RNA聚合酶需要TFIIH与DNA的起始点下游相互作用来离开启动子；TFIIH同样也参加了DNA的损伤修复。TFIIH核心在转录起始中和激酶结合在一起；而当遇到损伤DNA时，他就和修复复合体结合在—起。转录和修复之间的关系RNA聚合酶I启动子RNA聚合酶I只转录rRNA基因，它只有一类简单启动子，其包括：核心启动子（corepromoter）或核心元件（coreelement），位于-45到+20，负责转录的起始。通常是富含G-C，和一个富含A-T的短序列元件，环绕着起始点。上游控制元件（upstreampromoterelement，UPE），从-180延伸到-107，也是富含G-C。其可增加核心元件的转录起始的效率。RNA聚合酶I启动子转录起始复合体的装配RNA聚合酶I含有一个核心启动子，与上游启动子元件相隔约70bp当UBF因子结合到UPE上时，增加了核心结合因子结合到核心启动子上的能力而核心结合因子则使RNA聚合酶I定位于起始点上。核心结合因子由4种蛋白质组成，其中一个蛋白质成分即为TBP。这种因子在不同的物种中分别被称为SLl、TIF-IB或Ribl。RNA聚合酶III启动子RNA聚合酶III有两类启动子，它们由不同的转录因子通过不同途径识别：5SRN