常用中药的生物鉴定-PCR-课件

常用中药的生物鉴定

之聚合酶链式反应常用中药的生物鉴定1常用中药的生物鉴定方法免疫鉴定法电泳鉴定法生物效价鉴定法单纯指标鉴定法细胞生物学鉴定法DNA遗传标记鉴定法mRNA差异显示鉴定法常用中药的生物鉴定方法免疫鉴定法2聚合酶链式反应

(PolymeraseChainReaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。聚合酶链式反应(Polymeras3少量DNA样品快速扩增amplify技术。

(inventedbyKaryMullis,wonaNobelPrizeinChemistryin1993)少量DNA样品快速扩增amplify技术4原理原理5

PCR要件模板Template

引物

Primers:

SmallpiecesofDNA. Madeupof15to30bases.

BindstheDNAataspecificregion. forwardandreverse

正向和逆向酶Enzyme:

TaqDNApolymerase

PCR核酸Nucleotides:

Substrate,fourdeoxyribonucleotides(A,C,G,T) dNTPPCR要件6MDistH2O 117ul10Xbuffer 15uldNTP 12ulPrimer1 3ulPrimer2 3ulTaqpolymerase 0.75ul200ultubePipette上下混合MDistH2O 117ul200ultubePipe7取出15ul剩下的加入3ulTemplateDNA用pipette上下混合分装入tube15ul/支标上1…….51234554°C56586062RunPCRTcTc55°C不加模板的对照组M

取出15ul剩下的加入3ulTemplateDNA8加入1ul模板DNA不加引物但有模板的对照Pc加入1ul模板DNA不加引物但有模板的对照Pc915ulMTC3ultemplate(T)PipettemixTC15ul/tubepcPC123451ultemplateT15ulMTC3ultemplate(T)Pipe10TCPC1234554555657586062oCRNUTCPC1234554555611ProgramDenature95°C 5minDenaturation变性：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA，一般加热至90－95℃,30secAnnealing褪火：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链，55－70℃，固称其为褪火。mostimportantfactorinthePCR

,45secExtension延伸：在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链,温度为70－75ºC,1.5minFinalextension72°C,5minProgram12常用中药的生物鉴定-PCR-课件13常用中药的生物鉴定-PCR-课件14常用中药的生物鉴定-PCR-课件15常用中药的生物鉴定-PCR-课件16常用中药的生物鉴定-PCR-课件17常用中药的生物鉴定-PCR-课件18常用中药的生物鉴定-PCR-课件19常用中药的生物鉴定-PCR-课件20常用中药的生物鉴定-PCR-课件21常用中药的生物鉴定-PCR-课件22常用中药的生物鉴定-PCR-课件23常用中药的生物鉴定-PCR-课件242x1062x10625优点:needverysmallamountofsample缺点: amplifiedproductmaybecontaminated withothersamplesnotrelatedtothe one优点:缺点:26FactorsaffecttoPCRMg+2concentration,

Mg+2

specificity

0.1~5mmol/LMg+2预实验Primer(引物)specificityDegenerateprimer---tofindthetargetgeneinthecloselyrelatedspeciesspecificity,nonspecificproductsFactorsaffecttoPCR27AnnealingTemperature Toohigh noPCRproduct Toolow muchnonspecificproduct gradientTempPCRmachine findthesuitableTempTaqpolymerasequalityTemplate(模板)DNAqualityAnnealingTemperature28PCR产物鉴定Agarosegelelectrophoresistocheckproduct1.5%AgaroseinTAEbuffer(17ml)boilPourintothetray(assembledgelapparatus)PCR产物鉴定1.29常用中药的生物鉴定-PCR-课件30AfterPCRamplificationAgarosegelelectrophoresistocheckproduct1.5%agarosein17mlTAE(4mmthick)5ulproductadd1ul6Xloadingdyemix1Kbmarker2.5ul100Vrun25-30minEBstain10min(EB致癌物,戴手套),photographAfterPCRamplification311.51.00.50.2Kb10gammaprimerMismatch3base10gammaprimercompletematchKb10gammaprimerMismatch332PCR的应用1.detectiongeneticallymodificationorganism (GMO)检测转基因生物，找出特异的基因或片段 find

specificgeneorfragment(promoter)

2.unculturedmicroorganism3.pathogenidentification4.detectioninsertionsequence(cloning)PCR的应用33提取模板反应体系配置PCR扩增电泳引物设计提取模板反应体系配置PCR扩增电泳引物设计34乌梢蛇为《中国药典》(2019版)一部收载的一种常用中药，来源于游蛇科动物乌梢蛇[Zaocysdhumnades(Cantor)]的干燥体。有祛风、通络、止痉之功效。用于风湿顽痹、麻木拘挛、半身不遂、抽搐痉挛、瘰疠恶疮。商品流通中多以红点锦蛇、黑眉锦蛇、玉斑锦蛇、王锦蛇、灰鼠蛇等来混作正品药材进行销售，这些品种多数与乌梢蛇同科不同属，因其来源相近，造成鉴定困难。此外，药材在加工处理时剖去内脏后，要进行干燥熏黑处理，皮上的花纹特征、颜色几近消失，难以辨认，而且其大小、形态特征与乌梢蛇相近，这是造成其性状鉴别困难的另一重要原因。鉴于乌梢蛇作为中药的临床功效确切，但商品来源复杂、药材性状鉴别困难的现状，为满足目前市场常见混伪品的鉴别要求，寻找经济实用、准确便捷、稳定性高的方法，应用高特异性PCR方法对乌梢蛇药材及其混淆品的原动物和炮制品进行鉴别。乌梢蛇为《中国药典》(2019版)一部收载的一35高特异性PCR方法鉴别乌梢蛇及其混淆品高特异性PCR方法鉴别乌梢蛇及其混淆品36功效：祛风、通络、止痉。市售混淆品：红点锦蛇、黑眉锦蛇、玉斑锦蛇、王锦蛇、灰鼠蛇等功效：祛风、通络、止痉。37乌梢蛇高特异性

PCR鉴别引物的设计从GenBank下载正品原动物乌梢蛇及混伪品线粒体12SrRNA基因序列经DNAMAN软件对位排列分析正、混品间DNA序列差异，设计出一对能特异性扩增乌梢蛇12SrRNA基因片段的特异性鉴别引物HWL-1和HWH-1

（上海生工生物合成公司）乌梢蛇高特异性

PCR鉴别引物的设计从GenBank下载正品38模板DNA的提取

基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

模板DNA的提取基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸39特异性PCR鉴别反应体系：

Tris-HCl10mmol/L

氯化钾50mmol/LMg2+1.5mmol/LdNTP0.15μmol/LTaq1U(40ml)

引物0.15μmol/L

模板DNA50ng特异性PCR鉴别反应体系：40步骤预变性95°C 4min

变性95°C40sec褪火65°C1min延伸72°C30sec延伸72°C5min设置无DNA模板的阴性对照通用引物构成的阳性对照25cys步骤25cys41琼脂糖凝胶电泳取5μl反应液经1.8%琼脂糖凝胶电泳EB染色紫外凝胶分析检测成像琼脂糖凝胶电泳取5μl反应液经1.8%琼脂糖凝胶电泳42结果模板质量研究（1234为正品）高特异性PCR鉴别的研究结果模板质量研究43个体差异的研究炮制品特异性的研究个体差异的研究44PCR在其他中药中领域的应用中药材蛇胆的DNA分子标记鉴定研究-南京师范大学遗传资源研究所-王义权教授中药材蛤蟆油PCR鉴定-王义权鹿类中药材的位点特异性PCR鉴定研究-王义权PCR在其他中药中领域的应用中药材蛇胆的DNA分子标记鉴定研45常用中药的生物鉴定-PCR-课件46常用中药的生物鉴定

之聚合酶链式反应常用中药的生物鉴定47常用中药的生物鉴定方法免疫鉴定法电泳鉴定法生物效价鉴定法单纯指标鉴定法细胞生物学鉴定法DNA遗传标记鉴定法mRNA差异显示鉴定法常用中药的生物鉴定方法免疫鉴定法48聚合酶链式反应

(PolymeraseChainReaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。聚合酶链式反应(Polymeras49少量DNA样品快速扩增amplify技术。

(inventedbyKaryMullis,wonaNobelPrizeinChemistryin1993)少量DNA样品快速扩增amplify技术50原理原理51

PCR要件模板Template

引物

Primers:

SmallpiecesofDNA. Madeupof15to30bases.

BindstheDNAataspecificregion. forwardandreverse

正向和逆向酶Enzyme:

TaqDNApolymerase

PCR核酸Nucleotides:

Substrate,fourdeoxyribonucleotides(A,C,G,T) dNTPPCR要件52MDistH2O 117ul10Xbuffer 15uldNTP 12ulPrimer1 3ulPrimer2 3ulTaqpolymerase 0.75ul200ultubePipette上下混合MDistH2O 117ul200ultubePipe53取出15ul剩下的加入3ulTemplateDNA用pipette上下混合分装入tube15ul/支标上1…….51234554°C56586062RunPCRTcTc55°C不加模板的对照组M

取出15ul剩下的加入3ulTemplateDNA54加入1ul模板DNA不加引物但有模板的对照Pc加入1ul模板DNA不加引物但有模板的对照Pc5515ulMTC3ultemplate(T)PipettemixTC15ul/tubepcPC123451ultemplateT15ulMTC3ultemplate(T)Pipe56TCPC1234554555657586062oCRNUTCPC1234554555657ProgramDenature95°C 5minDenaturation变性：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA，一般加热至90－95℃,30secAnnealing褪火：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链，55－70℃，固称其为褪火。mostimportantfactorinthePCR

,45secExtension延伸：在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链,温度为70－75ºC,1.5minFinalextension72°C,5minProgram58常用中药的生物鉴定-PCR-课件59常用中药的生物鉴定-PCR-课件60常用中药的生物鉴定-PCR-课件61常用中药的生物鉴定-PCR-课件62常用中药的生物鉴定-PCR-课件63常用中药的生物鉴定-PCR-课件64常用中药的生物鉴定-PCR-课件65常用中药的生物鉴定-PCR-课件66常用中药的生物鉴定-PCR-课件67常用中药的生物鉴定-PCR-课件68常用中药的生物鉴定-PCR-课件69常用中药的生物鉴定-PCR-课件702x1062x10671优点:needverysmallamountofsample缺点: amplifiedproductmaybecontaminated withothersamplesnotrelatedtothe one优点:缺点:72FactorsaffecttoPCRMg+2concentration,

Mg+2

specificity

0.1~5mmol/LMg+2预实验Primer(引物)specificityDegenerateprimer---tofindthetargetgeneinthecloselyrelatedspeciesspecificity,nonspecificproductsFactorsaffecttoPCR73AnnealingTemperature Toohigh noPCRproduct Toolow muchnonspecificproduct gradientTempPCRmachine findthesuitableTempTaqpolymerasequalityTemplate(模板)DNAqualityAnnealingTemperature74PCR产物鉴定Agarosegelelectrophoresistocheckproduct1.5%AgaroseinTAEbuffer(17ml)boilPourintothetray(assembledgelapparatus)PCR产物鉴定1.75常用中药的生物鉴定-PCR-课件76AfterPCRamplificationAgarosegelelectrophoresistocheckproduct1.5%agarosein17mlTAE(4mmthick)5ulproductadd1ul6Xloadingdyemix1Kbmarker2.5ul100Vrun25-30minEBstain10min(EB致癌物,戴手套),photographAfterPCRamplification771.51.00.50.2Kb10gammaprimerMismatch3base10gammaprimercompletematchKb10gammaprimerMismatch378PCR的应用1.detectiongeneticallymodificationorganism (GMO)检测转基因生物，找出特异的基因或片段 find

specificgeneorfragment(promoter)

2.unculturedmicroorganism3.pathogenidentification4.detectioninsertionsequence(cloning)PCR的应用79提取模板反应体系配置PCR扩增电泳引物设计提取模板反应体系配置PCR扩增电泳引物设计80乌梢蛇为《中国药典》(2019版)一部收载的一种常用中药，来源于游蛇科动物乌梢蛇[Zaocysdhumnades(Cantor)]的干燥体。有祛风、通络、止痉之功效。用于风湿顽痹、麻木拘挛、半身不遂、抽搐痉挛、瘰疠恶疮。商品流通中多以红点锦蛇、黑眉锦蛇、玉斑锦蛇、王锦蛇、灰鼠蛇等来混作正品药材进行销售，这些品种多数与乌梢蛇同科不同属，因其来源相近，造成鉴定困难。此外，药材在加工处理时剖去内脏后，要进行干燥熏黑处理，皮上的花纹特征、颜色几近消失，难以辨认，而且其大小、形态特征与乌梢蛇相近，这是造成其性状鉴别困难的另一重要原因。鉴于乌梢蛇作为中药的临床功效确切，但商品来源复杂、药材性状鉴别困难的现状，为满足目前市场常见混伪品的鉴别要求，寻找经济实用、准确便捷、稳定性高的方法，应用高特异性PCR方法对乌梢蛇药材及其混淆品的原动物和炮制品进行鉴别。乌梢蛇为《中国药典》(2019版)一部收载的一81高特异性PCR方法鉴别乌梢蛇及其混淆品高特异性PCR方法鉴别乌梢蛇及其混淆品82功效：祛风、通络、止痉。市售混淆品：红点锦蛇、黑眉锦蛇、玉斑锦蛇、王锦蛇、灰鼠蛇等功效：祛风、通络、止痉。83乌梢蛇高特异性

PCR鉴别引物的设计从GenBank下载正品原动物乌梢蛇及混伪品线粒体12SrRNA基因序列经DNAMAN软件对位排列分析正、混品间