痰涂片镜检实验室质量保证手册

《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作术语注释质量保证（QualityAssurance，QA）是能持续提高实验室服务效率和可信度的体系，包括室内质量控制、室间质量评估和质量提高。质量控制（QualityControl，QC）也称室内质量控制。包括结核病痰涂片操作镜检实验室质量控制的所有方法，如仪器和染色液的检查等。室间质量保证（ExternalQualityAssessment，EQA）是根据与其他网络实验室（中间级实验室和中心实验室）比较批量检测和盲法复检结果评价基层实验室能力的过程。EQA包括实验室现场评估以评价操作质量并且也包括现场对涂片的复读。EQA是IUATLD描述的熟练度检测的扩大。质量提高（QualityImprovement，QI）是通过分析痰涂片镜检诊断服务的各组成部分，寻找能永久清除障碍成功的过程。数据收集、分析、创意思路都是这一过程的重要部分。它涵盖了连续监测、明确缺陷及后续改正措施，如必要时重新培训以杜绝问题再次发生。QI常依赖于有效的现场评估访视。现场评价（On-siteevaluation）国家或地区结核病规划下的地区督导员的常规对下级实验室的督导检查和高水平实验室督导员的年度督导检查。批量检测（PanelTesting）把已染色和/或未染色涂片从中心或国家参比实验室送到外围或中间级实验室以检查读片和报告的过程。批量检测和世界卫生组织定义的熟练度检测是等同的。盲法复检（Blinded-Rechecking）把涂片从外围实验室送到参比实验室（中间级或中心实验室）再次读片。指南推荐采用盲法复查，确保控制方事先不知道外围实验室的检查结果。其他文件中，这也被称做复读。涂片阳性率（Slidepositivityrate，SPR）在一定时间内一个实验室所有受检涂片（诊断或监测涂片）中阳性涂片的比例。高假阳性（HighFalsePositive，HFP）阴性片被错误地判读为2＋～4＋阳性。高假阴性（HighFalseNegative，HFN）2＋～4＋阳性涂片被错误地判读为阴性。量化误差（QuantificationError，QE）同一张阳性涂片受检方和控制方阳性判断级别的差异。低假阳性（LowFalsePositive，LFP）阴性涂片被错误地判断为低阳性（1＋以下）。低假阴性（LowFalseNegative，LFN）低阳性（1＋以下）涂片被错误地判断为阴性。第1页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作第一章绪论为了进一步加强结核病控制工作，实现全国结核病防治规划目标，加强直接面视下短程化疗的技术策略和结核病细菌学实验室质量控制，提高肺结核病人的发现率，通过实验室细菌学诊断传染性肺结核是实施DOTS策略的一个关键，而且对结核病控制项目的成功起着重要的影响作用。因此，在执行国家结核病防治规划中必须具备有效的结核病实验室网络。一个可信的实验室必须符合成本-效益原则，并且提供准确的实验结果，为此只有通过质量保证（QualityAssurance，QA）才能实现。结核病实验室质量保证的一个重要组成部分就是室间质量评估（ExternalQualityAssurance，EQA），即由上级参比实验室通过一系列的规范性活动来监督，不断完善实验室的质量保证程序，其质量保证有赖于国家结核病控制规划对各级实验室检查工作的支持、培训和监督，并逐步完善与国际接轨的质量保证管理系统。第一节目的和任务在结核病控制工作中痰结核菌检查对发现传染源、确定诊断和化疗方案、考核疗效、评价防治效果具有重要意义。因此，结核病细菌检查是国家结核病控制规划（NTP）的重要组成部分，在现代结核病控制工作中起着不可缺少的重要作用。第二节一、实验室网络及职能实验室网络及职能图1：实验室室间质量评估网络图（一）国家参比实验室1.制定我国各级结核病实验室痰涂片质量保证指南与实施细则。2.收集、整理、统计、分析国家室间质量保证信息资料。3.组织培训国家级质控督导员。4.计划、实施对下级实验室的定期督导检查。第2页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作5.指导、协调、评估各省（直辖市、自治区）参比实验室室间质量保证工作。6.开展我国结核病实验室室间质量保证方法的实施性研究。（二）省级参比室1.根据国家参比室和省结核病控制规划的需要，制定本省痰涂片室间质量保证实施计划。2.收集、整理、统计、分析省内室间质量保证信息、资料，按要求定期上报国家参比实验室。3.省级参比实验室负责省内质量保证的技术支持与培训；组织、协调、评估本省各市、县实验室室间质量保证工作。4.负责地（市）级和县级结核病实验室的现场评价(on-siteevaluation)、批量检测（PanelTesting）、随机抽样和委托初次复验者盲法复检。5.承担地（市）级结核病实验室盲法复检的再次复验者复检工作。6.指导、监督地（市）级实验室实施县级实验室室间质量保证工作。（三）地（市）级结核病实验室1.根据国家参比室和省参比室的要求，制定本地区痰涂片室间质量保证实施计划。2.收集、整理、统计、分析本地区内室间质量保证信息资料，定期上报省参比实验室。3.负责辖区内结核病实验室质量保证的技术支持与培训；组织、协调、评估各县实验室的室间质量保证工作。4.做好本实验室痰涂片镜检和室内质控工作，接受省参比室定期室间质量保证督导。5.承担同级间实验室（地、市）初次复验者盲法复检工作。6.负责实施县级结核病实验室的现场评价、批量检测、盲法复检和再次复验者的复检工作。（四）县级结核病实验室1.做好本实验室痰涂片镜检和室内质控工作，接受上一级参比室定期室间质量保证督导。2.承担同级间实验室（县级）初次复验者盲法复检工作。第二章痰涂片检查第一节痰涂片的意义在当前国家结核病控制措施的框架下，抗酸杆菌（acid-fastbacilli，AFB）镜检的目的是：一、传染性结核病的诊断指标：目前，控制结核病流行以发现和控制传染源为主。现在认为，痰涂片AFB阳性的肺结核患者是传染源，对未经细菌检查证实的肺结核患者成为“可第3页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作疑肺结核患者”；故痰涂片AFB镜检结构对诊断传染性肺结核是一项重要指标。二、评价传染性结核病的化疗效果：由于目前结核病的药物化疗方案，其原理主要是根据结核分枝杆菌的生物学特征而制定的，所以对化疗效果的评价，也必须以AFB细菌学检查结果作为根据。三、为结核病疫情的流行病学统计服务：由于传染性结核病在流行病学中有着特殊的意义，因此，在反映某一国家或地区结核病疫情的严重程度的指标中，涂阳患者率、涂阳发病率被更多关注。根据世界卫生组织（WHO）和国际防痨及肺部疾病联合会（IUATLD）针对低收入且结核病疫情严重的发展中国家所制定的技术指南，痰涂片AFB镜检是相应国家开展结核病控制项目时，非常符合成本效益原则的细菌实验技术，相对于临床和实验室经常采用的其它诊断和检查项目，高质量的AFB镜检方法有其特有的优势：1.作为诊断手段，对传染性肺结核的诊断比X线的准确性高；2.作为实验方法，技术相对简单，容易标准化和完成操作‘3.建立AFB检查时所需设备投入少；4.检查成本低，易于接受；5.从受到标本到报告结果的时间短，能够满足临床诊断的需要；6.对菌阳患者的治疗效果，能够作为及时和准确的评价。第二节分枝杆菌的形态和结构一、分枝杆菌的形态当患者标本直接进行涂片镜检时，能够发现不同的分枝杆菌形态变化较多。结核分枝杆菌多数为杆状、稍弯曲；菌体宽度0.3～0.6µm；菌体长度不一，在0.5～8µm之间，多数在1.5～3.5µm；少数菌体较长者可呈螺旋状；染色良好的结核分枝杆菌菌体内，能够发现着色较深的异染颗粒，含结核分枝杆菌较多的新鲜标本经萋尔-尼尔逊染色（Ziehl-Neelson，Z-N，简称萋-尼氏染色），100×油镜观察，能够发现单个存在的细菌、也能看到聚集成簇或分枝状排列的细菌，多数非结核分枝杆菌（non-tuberculosismycobacteria，NTM）的形态较结核分枝杆菌短且粗，呈棒状、短棒状甚至颗粒状。培养生长的菌落经生理盐水研磨、悬浮物稀释后涂片镜检，结核分枝杆菌的形态较标本直接涂片的稍短且粗，常聚集而形成“索状”；经培养的NTM菌体形态与临床标本中的比较变化不大、且较少聚集。二、结核分枝杆菌的结构第4页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作分枝杆菌由于细胞结构和细胞成分的特殊性，具有经碱性染料染色后，能够耐受酸性介质脱色的特征，具备相应染色特征的细菌习惯上被称为抗酸菌（acid-fastbacillus，AFB）。目前，除结核分枝杆菌以外（临床上最为常见的分枝杆菌），发现的分枝杆菌种类已达100余种。当然，除分枝杆菌以外，还有少数细菌具有抗酸染色的特征。AFB菌体细胞结构的完整性与其抗酸染色特性有着密切联系。通过电子显微镜观察分枝杆菌，完整的细胞结构主要有以下部分组成：（一）细胞壁：分内、中、外三层；外层细胞壁的主要成分－分枝菌酸，是造成分枝杆菌细胞抗酸染色特性的主要成分，中层细胞壁的只要成分有肽脂糖和磷脂蛋白，内层细胞壁的主要成分是多糖体，分枝杆菌细胞壁的组分和结构的完整性，对相应细菌的抗酸染色特性起到关键作用。（二）细胞膜：主要由脂蛋白组成。部分细胞膜通过折叠、卷曲，能够形成层状结构被称为中介体（或间体）的细胞器。（三）细胞质：本身致密性交叉。（四）核区：因遗传物质DNA和参与表达的RNA较密集而成。（五）细胞器：有主要成分为甘油三酯、抗酸染色的能力较差的脂质空泡，和主要成分是聚磷酸盐、具有较强的抗酸脱色性的异染小体（异染颗粒）等。第三节检查对象根据《国家结核病防治规划指南》的有关规定，检查对象根据检查目的分为两类：一、确定诊断：凡因结核病症状求诊及转诊的可疑结核患者，均应进行直接涂片检查。一般包括持续咳嗽、咳痰超过3周；咯血或伴有血痰；发热或胸痛超过2周；胸部X线异常。确定诊断的涂片检查应采集3个合格的痰标本。就诊当时在门诊留一份“即时痰”标本，同时给患者2个痰盒，嘱患者留取“夜间痰”和“晨痰”，于次日交验。二、疗效评价：凡已确诊、登记、治疗的肺结核患者，在化疗期间按照规定应定期查痰：（一）初次涂阳患者在疗程强化期末、继续期满3个月和继续结束时，复治涂阳患者在疗程强化期末、继续期满3个月和继续期结束时，各查一次晨痰。（二）初、复治涂阳患者在疗程强化期接受时，痰菌仍为阳性者，应在1个月时增加晨痰检查一次；若复治涂阳患者治疗满3个月时痰菌仍阳性，应在治疗满5个月增加晨痰检查一次。（三）确诊、登记的涂阴肺结核患者，即使患者因故未接受治疗，也应在登记后满2和6个月时进行痰菌检查。第5页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作第四节一、标本采集：（一）用于采集标本的容器：采用WHO推荐的国际通用螺旋盖痰瓶（见图2），或可密封塑料盒、蜡纸盒收集痰标本（参考规格：直径4cm，高2cm）。痰容器上应标明病人的姓名、编号（初诊病人门诊序号或随访病人登记号）、检查项目、容器序号1、2、3（1＝当日即时痰，2＝夜间痰，3＝次日晨痰）。痰标本的采集图2（二）标本的性状：标本容器合格的痰标本应是患者深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物。1、干酪痰：标本外观以黄色（或奶酪色）脓样、团块状的肺部分泌物为主，粘度较粘液痰低，制片时较易涂抹；涂片染色后镜检，可见大量脓性炎症细胞、肺上皮脱落细胞。由于此类标本是由肺部深处咳出，对肺结核的诊断最有价值，故AFB的检出率较高。2、血痰：此类标本是因粘液痰或干酪痰标本中混有血液而形成，颜色为褐色或深褐色、鲜红色或伴有血丝；涂片染色后镜检除能够观察到粘液痰或干酪痰的细胞特征外，含新鲜血液的标本中还可见到被染色的红细胞。由于含血标本易干扰AFB镜检的结果，故在制片时应尽量避免挑取含血标本。3、粘液痰：标本外观以白色、粘稠度较高的肺部和支气管分泌物为主，制片时需仔细涂抹；涂片染色后镜检时，镜下可见支气管内膜纤毛柱状上皮细胞（细胞较长且形态不规则、细胞核和细胞质着色均较深，细胞一端可见着色较浅的纤毛），伴有少量肺上皮脱落细胞（多数为圆形，细胞核较小，且着色较细胞质深，核质比＞1:3）、脓性炎症细胞（卵圆形、细胞核占细胞比例较大且着色较深，核质比＜1:1）、口腔脱落细胞及口腔寄生菌。此类标本的AFB检出率较唾液高。4、唾液：目视观察标本外观，以透明或半透明水样、粘度较低的口腔分泌物为主，标本中有时伴有气泡；涂片染色镜检时，镜下可见少量口腔上皮脱落细胞（形态不规则、细胞核第6页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作着色较细胞质深，核质比接近或＞1:2）和口腔内寄生菌，有时可见食物残渣。由于此类标本进行AFB检查时的检出率很低，用于患者确定诊断时是不合格的标本。（三）标本采集：根据痰标本采集的时间，可将标本分为三类：即时痰：就诊时深呼吸后咳出的痰液。晨痰：患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第2口、第3口痰液。夜间痰：送痰前一日，患者晚间咳出的痰液。进行AFB检查的医疗机构应提供符合要求的标本收集容器，医务人员在容器上应注明患者姓名、编号（门诊序号或登记号）、检查项目、痰标本序号，然后交给患者。对疑似肺结核病者，临床医护人员应通过解释，使其充分了解标本质量对相应检查项目的重要性，示范并指导其掌握从肺部深处咳痰的方法；如患者识字，可提供宣教材料。（注意：由于当患者咳嗽、咳痰时，易于产生含有结核菌的气溶胶，感染周边人群的机率较高，故采集痰标本时应在远离人群的开放空间进行，或在通风良好的室内进行。）患者留取的痰标本，应由检验人员或经培训的专人目视检查标本质量（特别是用于初次诊断的痰标本）：标本量一般在3～5ml，标本性状属于干酪痰、褐色血痰或含少量新鲜血液的血痰、粘液痰者为合格的标本；痰标本不合格者，应予以进一步指导并要求其重新送检。进行细菌学检查时，应在登记本和检验报告单上注明标本性状，以供分析结果时参考。第五节涂片抗酸染色检查方法抗酸染色的基本原理：抗酸菌具有耐受酸性介质脱色的生物性状，此类细菌在石炭酸（苯酚）的协同作用下，被复红染色剂着色，能够耐受酸性酒精脱色，显微镜观察时保持紫红色；而其它脱落细胞或标本中的非抗酸菌被酸性酒精脱色后，可被复染剂亚甲蓝染为蓝色。一、玻片的制备：（一）用于AFB检查的载玻片要求：1.一张载玻片上只能涂抹一份痰标本。2.每张载玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于AFB涂片检查；3.应使用以95%乙醇擦拭（浸泡）脱脂，经干燥、清洁、无油污、无划痕的新玻片制备涂片，在玻片背面一端的1/3处注明实验室序号及标本序号（如使用的载玻片一端无磨砂面，必须使用玻璃刻刀注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可用2B铅笔在磨砂面上直接书写）。第7页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作（二）制备涂片：小心打开留取痰标本的容器，防止产生气溶胶或使标本外溢（最好在超净工作台中操作）。仔细观察标本，使用折断的竹签茬端，挑取痰标本中干酪样、脓样或可疑部分约0.05～0.1ml，于玻片正面右侧2/3，处均匀涂抹成10mm×20mm的卵圆形痰膜。痰膜朝上静置，自然干燥后（一般约需要30分钟）进行染色镜检。涂抹完毕后的痰标本，在报告结果前应暂时保留。为保证检验人员的安全，严禁在涂抹痰标本的同时，对载玻片进行加热。二、萋尔－尼尔逊染色法（Ziehl-Neelson，Z-N，简称萋－尼氏染色）：（一）试剂的配制1．石炭酸复红染液：（1）储存液①碱性复红液：碱性复红8g，加95%乙醇至100ml，充分振荡使复红溶解。碱性复红乙醇储存液应避光保存，为保证染液的质量，建议储存液保存不超过6个月。②5%石炭酸水溶液：40～50℃水浴加热石炭酸使之融解，取液态石炭酸5g溶于90ml热蒸馏水中，待溶液冷却至室温时，补充蒸馏水至100ml。（2）石炭酸复红工作液：经定性滤纸过滤的碱性复红储存液10ml与5%石炭酸水溶液90ml充分振荡、混合均匀后，用定性滤纸过滤。碱性复红（或称为碱性品红，basicfuchsin，orpararosanilinechloride，分子式为C19H18NCl）用于AFB染色时，必须使用染料最低含量超过88%的生物染色剂，合格产品一般在试剂包装上注明相应含量。如果标注的染料含量低于88%，则在配制时需调整称取量。例如，染料含量标注为75%的产品，配制100ml储存液时实际的称取量应是8/0.75=10.7g。②石炭酸（苯酚，phenol，分子式为C6H6O）:应使用熔点为40.5℃的分析纯试剂。2．5%盐酸乙醇脱色液：35%浓盐酸5ml与95%乙醇95ml混合。3．亚甲蓝复染液：（1）储存液：亚甲蓝0.3g溶于95%乙醇50ml中，完全溶解后加蒸馏水至终体积100ml。（2）亚甲蓝复染液：以蒸馏水5倍稀释0.3%亚甲蓝储存液，经充分振荡、混合均匀后，亚甲蓝的终浓度为0.06%，使用定性滤纸过滤，即得亚甲蓝染液。亚甲蓝（methylenebluechloride，ormethylthioninechloride，分子式为C16H18ClN3S）：染色时必须使用染料含量超过82%的生物染色剂。第8页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作4．萋－尼氏染色步骤：1.涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持10mm以上的距离；火焰固定（在5秒钟内将玻片置于火焰上烤4次）。2.滴加石炭酸复红染液，盖满痰膜，火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染色5分钟。染色期间始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液。加温时勿使染色液沸腾。3.流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。4.自痰膜上端外缘滴加脱色剂布满痰膜，脱色1分钟；如有必要，需流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止。5.流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。6.滴加亚甲蓝复染液，染色30秒钟。7.流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，然后沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检。一张染色合格的玻片，由于被亚甲蓝染色而呈亮蓝色。将染色后的玻片放置在报纸上，如果透过痰膜不能分辨报纸上的文字，表明该玻片涂抹过厚。三、荧光染色法：AFB采用荧光染色法镜检，只限于那些日常工作量较大（日读片数超过25张）、具备荧光显微镜、且镜检人员阅读荧光染色玻片具有丰富经验的实验室开展。（一）试剂配制1.染色剂（金胺O染液）金胺O☆石炭酸乙醇补蒸馏水至☆1501001000gmlmlml金胺O（auramineO，分子式为C17H21N3·HCl）：用于AFB染色时必须使用最低染料含量约80%的生物染色剂。2.3.脱色剂：3%盐酸乙醇（配制方法参照萋尼氏染色）。复染剂：0.5%高锰酸钾水溶液。（二）染色步骤：1.玻片经火焰固定，滴加染色剂盖满玻片，染色30分钟；流水自玻片一端轻缓冲洗，洗去染色液，沥去玻片上剩余的水。第9页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作2.自痰膜上端外缘滴加染色剂，布满痰膜，脱色3分钟或至无色，流水自玻片一端轻洗，洗去脱色剂。3.滴加复染剂复染2分钟，沥去复染剂，自然至干燥，准备镜检。四、镜检读片：（一）萋－尼氏染色玻片镜检使用10×目镜双目显微镜读片。取染色完毕且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片台上并以卡尺固定。首先使用40×物镜，转动卡尺移动玻片至痰膜左端，将光线调节至适当亮度，调节焦距至可见细胞形态；移开40×物镜，在玻片上滴1～2滴镜油，使用100×油镜进行细致观察。在淡蓝色背景下，抗酸菌呈红色，其他细菌和细胞呈蓝色。为防止AFB的交叉污染，严禁油镜镜头直接接触玻片上的痰膜。由于香柏油（cedarwoodimmersionoil）能溶解复红染料，使萋-尼氏染色退色，并且容易干燥凝结，对油镜头造成损害，故推荐使用专门用于100×油镜、不干燥、不变硬的镜油（immersionoil）。读片时，首先应从左向右观察相邻的视野，当玻片移动至痰膜一端时，纵向向下转换一个视野，然后从右向左观察，依此类推。通常10mm×20mm的痰膜，使用100×油镜，每行可观察约100个视野。仔细观察完300个视野，一般需要5分钟以上；每个工作日，一位镜检人员的玻片阅读量不要超过25张，且连续阅读10～12张玻片后，应休息20分钟左右。图3（二）荧光染色玻片镜检：镜检读片移动方式玻片放置在载片台上并以卡尺固定后，首先以10×目镜、20×物镜进行镜检，发现疑似为AFB的杆状荧光颗粒时，使用40×物镜确认。在暗背景下，抗酸杆菌发出杆状荧光。第10页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作相应波长光线激发染料产生可视光的能力，随着时间而衰减。故荧光染色后的涂片应于当日镜检；如果玻片数量过多，应将涂片放置于4℃避光保存，次日必须完成镜检。五、镜检结果报告：由于与疾病传染性的程度及其相应严重程度密切相关，故镜检时发现细菌的数量是非常重要的参考依据。因此痰涂片镜检的结果报告，不仅是对疾病的定性，也是对疾病严重程度的半定量。（一）萋－尼氏染色镜检结果分级报告标准：抗酸杆菌阴性（－）：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。报告抗酸杆菌菌数：1～8条/300视野。抗酸杆菌阳性（1+）：3～9条/100视野。抗酸杆菌阳性（2+）：1～9条/10视野。抗酸杆菌阳性（3+）：1～9条/每视野。抗酸杆菌阳性（4+）：≥10条/每视野。（二）荧光染色镜检结果分级报告标准：荧光染色抗酸杆菌阴性（－）：0条/50视野。荧光染色报告抗酸杆菌阳性（报告抗酸菌数）：1～9条/50视野。荧光染色抗酸杆菌阳性（1+）：10～99条/50视野。荧光染色抗酸杆菌阳性（2+）：1～9条/每视野。荧光染色抗酸杆菌阳性（3+）：10～99条/每视野。荧光染色抗酸杆菌阳性（4+）：≥100条/每视野。六、抗酸染色玻片的保存：阅读完萋－尼氏染色玻片后，应及时用浸满二甲苯（分析纯）的擦镜纸揭取数次，彻底去除玻片上的镜油。经脱油、干燥后的玻片，按实验室序号及涂片编号放置在玻片盒中，存放在阴凉干燥的环境中，以备复检或质控抽检。荧光染色的玻片，玻片盒中放置干燥剂后密封放置在4℃冰箱保存。荧光染色涂片质控时，应首先将复检涂片进行萋－尼氏染色后，重新阅读。七、痰涂片抗酸染色检查注意事项（一）AFB痰检假阳性结果的预防措施1.2.必须使用新的载玻片进行痰涂片检查。每个标本均使用一个新竹签完成制片涂抹。第11页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作.7.8.9.所有染液均经过过滤。染色时玻片彼此之间保持一定距离，相互彻底分隔开。严禁使用染色缸将玻片放置一起染色。染色时勿使玻片上的染液干燥。滴加镜油时，严禁容器滴口直接接触玻片痰膜。严禁物镜镜头直接接触玻片痰膜。完整、准确的标注痰盒、玻片和实验室登记本的各项内容。10.登记前、后对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。11.准确记录和报告结果。（二）AFB痰检假阴性结果的预防措施..9.确认标本是痰而非唾液。确认每份标本至少有3ml。选择脓样、干酪样、粘液分泌物涂抹制备玻片。制备玻片时标本涂抹均匀，不要太厚或太薄。使用高质量染料、严格按照配方配制染液。严格按照操作程序完成染色过程。判断结果为“阴性”前，必须阅读规定要求的视野数。作为对照，可采用已知结果为阳性的玻片，完成染色镜检过程。完整、准确地标注痰盒、玻片和实验室登记本。10.登记前对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。11.准确记录和报告结果。第六节涂片抗酸染色检查材料管理一、显微镜日常维护显微镜作为发现涂片阳性病人的重要设备，实验室工作人员应正确使用并给予正确维护，以保证其正常工作和延长使用寿命。在使用和维护显微镜时应特别遵守下列要点：1.显微镜应放置在干燥、无尘和通风的环境中。如果显微镜一段时期内停止使用，应拆开并放置在原包装盒内，并放置有效的干燥剂。2.使用前和使用后必须使用擦镜纸彻底清洁物镜。3.严禁物镜镜头直接接触玻片上痰膜。4.使用油镜时，只能使用细螺旋调节焦距。第12页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作5.使用电光源显微镜时，注意电压和电流是否与仪器要求相匹配。二、AFB镜检耗材管理:为保障痰涂片检查工作能够连续不断开展，应储存一定数量的实验耗材和相应试剂，储备量可根据既往每季度工作量来进行评估，一般应准备比平均工作量高20%的相应耗材和试剂。每个查痰点每检查1000份痰标本所消耗的材料列表如下表1实验室准备耗材材料、试剂名称痰盒竹签载玻片镜油复红金胺O（如使用荧光染色）石炭酸亚甲蓝浓盐酸☆用量（每检查1000份痰标本）1100110011001104052501.5500个个张mlggggml备注每张玻片染色使用两种染液各约5ml、脱色液约10ml95%酒精☆10000ml6110110张ml本个定性滤纸二甲苯擦镜纸载玻片盒(100张/盒)☆盐酸、酒精的消耗量根据脱色情况可能需要调整。参考文献：1.《全国结核病防治工作手册》，卫生部疾病控制司、卫生部医政司编，1999。2.TechnicalGuide.SputumExaminationforTuberculosisbyDirectMicroscopyinLowIncomeCoutries.5thedition,IUATLD,2000.3.TheMicoscope.APracticalGuide.WHOProject:ICPTUB001.NewDelhi,India:WHORegionalOfficeforSouth-EastAsia,1999.4.LaboratoryBiosafetyManual.2ndedition.Geneva:WHO,1993:60-61.第13页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作附件1：检验单参考样式结防所（科）痰结核杆菌检验单姓名(初诊病人)门诊序号：痰涂片检查结果：送检医生：报告人：送检日期：报告日期：性别年龄实验序号：(随访病人)登记号：附件2：结核病细菌学实验室登记本痰标本来源实验日姓性年初诊病人初诊病人随访病人序号期名别龄住址(门诊序号)(登记号)123123说明：痰性质按照痰标本为：干酪痰、血痰、粘液痰分别填写，唾液为不合格痰，应嘱病人重新送合格的痰标本。标本性质结果日期签名备注标本镜检结果第14页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作第三章痰涂片实验室质量保证按照世界卫生组织（WHO）和国家结核病防治规划（NTP）的要求，在我国已全面推行DOTS策略或DOTS策略得到良好贯彻执行的地区，为了持续提高结核病实验室痰涂片检查的工作效率和可靠性，必须建立我国结核病实验室质量保证系统网络，在实验室内部质量控制的基础上，应用实验室间质量检查和评估方法，进行实验室检查系统的评价，并通过采取一系列措施改经和不断提高实验室业务总体水平。第一节室内质量控制室内质量控制（QualityControl，QC）是指实验室内部的操作规程、设备和耗材、痰标本收集、染色剂制备、涂片制备和染色、显微镜维护、显微镜镜检、结果登记和报告、以及痰片保存等整个过程中的内部检查和监测。一、痰标本收集（一）容器：采用WHO推荐的国际通用螺旋盖痰瓶，或可密封塑料盒、蜡纸盒收集标痰本（参考规格：直径4cm，高度2cm）。痰容器应标明病人姓名、日期、编号（初诊病人门诊序号或随访病人登记号）和容器序号1、2、3（1＝当日即时痰，2＝夜间痰，3＝次日即时痰）。（二）痰标本性质：干酪痰、血痰、粘液痰为合格标本；唾液或口水为不合格标本，除照常进行涂片检查外，应要求患者重新送检。（三）初诊病人应收集3份痰标本（当日即时痰、夜间痰和次日晨痰）、治疗中或复诊随访病人安装每次收集2份痰标本（当日即时痰、当日或次日晨痰）。（四）对当日不能进行涂片检查的标本，须置于4℃冰箱保存，注意防止痰液干涸或污染。二、抗酸染色液制备（一）有染色液制备配方和配置记录。（二）染色液试剂瓶须表明染色液名称、浓度和制备时间。（三）染色液置于棕色瓶内存放，避光保存。三、载玻片（一）新载玻片应经95%乙醇脱脂，检查无划痕后方可使用。（二）一张载玻片只能涂抹1份痰标本。（三）载玻片只允许一次使用，严禁清洗后重复使用。（四）载玻片正面左侧1/3处标注实验室序号（如使用的载玻片一端无磨砂面，必须使用玻璃刻刀注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可用2B铅笔在磨砂面上直接书写）。第15页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作（五）载玻片正面右侧2/3中央处均匀涂抹成面积为10×20mm的卵圆形痰膜。四、染色（一）肉眼观察染色后的痰膜应呈均匀亮蓝色，无红色斑块。（二）将染色后的玻片放置在报纸上，如果透过痰膜不能分辨报纸上的文字，则表明该玻片涂抹过厚。（三）染色后的痰膜脱离部分应小于整个涂抹面积的10%。五、镜检要求（一）为防止抗酸菌的交叉污染，严禁油镜头直接接触涂片上的痰膜。（二）仔细观察300个视野。（三）每个工作日，一名镜检人员的涂片阅读量不应超过25张。（四）连续阅读10～12张涂片后，应休息20分钟左右。（五）采用自查和互查方式，至少抽查复检当日10%涂片，并填写室内质控登记表（表2）。表2室内质量控制每日涂片抽查复检登记表20日期合计镜检涂片数阴性阳性初检者签名抽查复检涂片数痰涂片符合数年月复检者签名第16页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作合计六、登记报告（一）登记前后应对检验单、标本盒、涂片上的标注进行反复核对。（二）检查后的每一张涂片结果，应按规定准确记录在“结核病细菌学实验室登记本”上。（三）镜检结果报告应及时发出，以便尽早为临床提供诊断依据。七、痰涂片保存（一）镜检后的涂片应及时用浸满二甲苯（分析纯）的擦镜纸揭取数次，彻底祛除涂片上的镜油。（二）涂片脱去镜油后，必须再次核对实验室登记本与每张涂片实验序号。（三）涂片上严禁标记镜检的阴、阳性结果。（四）全部涂片按实验室登记本序号连续排列，存放于玻片盒内。第17页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作（五）涂片保存与实验室登记本记录应一致。初诊病人每一张涂片存入涂片盒后需预留出两个空位置，以备第二张、第三张涂片检查后放入；随访病人第一张涂片存入涂片盒后需要预留出1个空位置，以备第二张涂片检查后放入。（六）按规定数量保存的用于室间质量评估的涂片，未经上级质控单位准许不能自行销毁。（七）装满涂片的玻片盒，需用标签注明涂片实验序号区间和日期区间，以便日后盲法复检或现场评价时抽样。第二节室间质量评估室间质量评估是根据与其它网络实验室（中间级实验室和中心实验室）比较批量测试和盲法复检结果评价基层实验室能力的过程。EQA包括实验室现场评估以评价操作质量并且也包括现场对涂片的复读。EQA是国际肺病和防痨联合会描述的熟练度检测的扩大。一、现场评价（一）要求：1.现场评价之前首先建立下级实验室技术档案，由被督导实验室填写附件1"结核病实验室基本情况登记表"，每次现场评价时需重新核实登记内容。2.国家参比室每年对省级参比室至少进行1次现场评价，同时每省至少抽查一个市、县级结核病实验室。3.省级参比室每年对所辖市级实验室至少进行1次现场评价，同时每地（市）抽查1～2个县级实验室；必要时，对批量检测或盲法复检存在问题的市、县实验室，适当增加现场评价频率。4.市（地）级实验室每年对所辖县（区）实验室每年至少进行2次现场评价。5.对批量检测或盲法复检存在问题的县级实验室必须尽快查找原因，提高涂片镜检质量。6.现场督导员应由经验丰富的实验室技术人员担任，必须经高一级实验室有资格督导员培训后方可上岗。7.现场评价要按本操作细则所列项目顺序进行，评价结果可结合当地结核病控制工作考核评比给分。8.现场督导员的主要责任是通过现场评价发现问题，提出正确的建议解决问题，提高痰涂片镜检质量。9.上级实验室对下级进行督导的时候，应当核对调查表和评估实验室实际情况，为此各级调整表应当保存五年以上。（二）检查步骤：现场评价操作步骤第18页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作1.试剂检查的问题试剂名称现在的染色剂是否都可使用？最近3个月是否试剂短缺？使用试剂是否在有效期内？镜油粘度是否合适？石炭酸复红亚甲蓝5％盐酸乙醇镜油二甲苯如有填写“否”的项目，请简要说明原因：指可用性是是是是是否否否否否标足够用量是是是是是否否否否否2.供应检查的问题原料玻片储片盒标准痰盒下列原料可以是否得到？痰盒规格是否标准？是否供应存放的储存片盒符合规定标准？是否数量足够？近3个月是否供应短缺？有否蒸馏水？水是否保存在无菌瓶子里？玻片记号笔竹（木）签漏斗滤纸染色架灯或燃器灯用燃料擦镜纸玻璃刻刀供水天平指可用性是是是是是是是是是是是是是是否否否否否否否否否否否否否否标质量是否优良是是是是是是是是是是是是是是否否否否否否否否否否否否否否充分供应是是是是是是是是是是是是是是否否否否否否否否否否否否否否第19页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作如有填写“否”的项目，请简要说明原因：3.实验室安全检查的问题痰涂片检查在哪里进行？指标结果是否在一个与其它实验室隔开的地方进行有保证涂片和镜检独立操作的桌子是否是否实验室是否通风？如果在打开的窗前涂片，技术员是否知道气流方向和潜在的危险？用哪种消毒剂？近3个月有消毒剂的短缺吗？实验室多长时间消毒一次？用过的玻片怎样处理？是否可重复使用？有充分的安全通风系统使用针对TB的消毒剂消毒剂供应充足工作的地方应当每天清洁消毒已经涂抹过标本的玻片不允许重复使用是否是否是否是否用过的痰容器怎样处理？是否可重复使用？痰容器为一次性使用，用过的痰容器应销毁是否是否有生物危害废物桶？是否有实验室防护服？离开实验室前是否应该脱掉试验服？实验室是否使用手套？使用是否合适？使用有盖的生物危害废物桶在实验室应穿好防护服试验服不能穿出实验室以外应戴防护手套，手套的种类应符合所从事安全工作的要求是否是否是否是否试验结束后是否洗手？实验室是否有上下水？实验室是否洁净有序？下班后，是否关闭实验室门窗？是否例行安全检查？如有填写“否”的项目，请简要说明原因：遵守正确的洗手程序实验室应当有上下水干净整洁，物品摆放有序关闭好门窗，巡视检查。确保安全后离去是否是否是否是否第20页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作4.显微镜检查的问题是否有显微镜？数量是否充分？显微镜功能是否正常？指标结果是否至少有一台专用于分枝杆菌的显微镜。还有另外的显微镜备用。随机镜检，通过显微镜能观察到清晰的视野、机械调节性能良好。是否显微镜工作场所合适吗？是否有充足的光源？场所能够适当变更具备功能良好的灯泡和电源，或显微镜放置在适当的光源处是否是否是否常规维护显微镜？有油镜头，且功能完好整机干净清洁，有专人负责常规检查维护是否是否双目显微镜？是双目显微镜是否如有填写“否”的项目，请简要说明原因：5.用于室间质量评估的玻片储存检查的问题所有保存的玻片，是否符合室间质量评估计划的要求？所有玻片是否保存在玻片盒内？玻片盒上是否有标记？所有玻片保存之前是否经二甲苯脱油？玻片盒内玻片有无交叉污染？指标结果是否玻片保存符合室间质量评估规定，所有玻片保存与结核病实验室登记本一致。玻片保存在玻片盒内，玻片盒上应按室内质控要求，标记实验序号和时间。玻片保存之前必须经二甲苯处理，玻片之间无重叠污染。是否是否如有填写“否”的项目，请简要说明原因：第21页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作6.涂片、染色和镜检检查的问题痰盒上病人标记是否完善？是否使用新的玻片进行抗酸杆菌痰涂片？所有的玻片，使用前是否清洁？涂片上是否有标记？石炭酸复红多长时间过滤一次？亚甲蓝多长时间过滤一次？指标结果是否是否痰盒上标记有病人姓名及痰盒序号使用新的玻片进行抗酸杆菌痰涂片，玻片使用前要清洁处理涂片按要求标记实验序号石炭酸复红至少每周过滤一次亚甲蓝至少每月过滤一次，如果涂片上见到沉淀物及时过滤是否是否是否涂抹一张涂片是否使用一个新木签？固定以前，涂片是否在空气中干燥？涂片是否经过加热固定？通常一批染色多少张涂片？每张涂片使用一个新木签固定以前，涂片在空气中要干燥完全经火焰3～5次加热固定一批最多10～12张涂片石炭酸复红热染5分钟，染色剂不允许是否是否是否是否染色过程是如何进行的？用石炭酸复红和亚甲蓝染色要多久？怎么脱色？在玻片上干燥，盐酸酒精脱色一分钟，仅必要时重复脱色，不要脱色过度，亚甲蓝复染1分钟是否染色剂做质量检测吗？试剂必须用已知阳性玻片进行检验，至少每月一次是否显微镜用多久用擦镜纸清理一次？报告一个阴性结果要观察多少个视野？报告一个阳性结果要观察多少个视野？检查完每张涂片后，均擦干物镜300个视野应当检查足够的视野以提供精确的数量等级。菌量少时至少100个视野是否是否是否是否掌握阳性涂片的分级报告标准？准确掌握阳性结果的分级报告标准是否如有填写“否”的项目，请简要说明原因：第22页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作7.现场复检7A现场评价时督导员至少要抽查3张阳性涂片试验序号＋＋＋7B痰片复检评价复督导结果与实验室的结果一致吗?抗酸杆菌染色和背景染色可以接受吗？背景材料显示，是痰吗？涂片厚度适当吗？涂片面积大小合适吗？如有填写“否”的项目，请简要说明原因：检评价是否是否是否是否是否自检结果督导结果抗酸杆菌染色背景染色痰或唾液涂片厚度和大小8.督导小组检查和/或复检印象（1）现场督导和复检结果按国家结核病防治规划要求是可以接受的吗？（2）如果不是，通过现场督导发现的问题需要纠正吗？请解释纠正措施的必要性：是否是否9.盲法复检痰片抽样（详见“盲法复检”）10.现场评估概述第23页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作列出现场检查钟的主要问题，并提出解决的办法：A.操作问题：B.技术问题：C.设备及供应问题：现场评估人签名：第24页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作二、盲法复检（一）盲法复检原则1.从各个实验室抽取的涂片样品必须是随机选出，并能代表整个实验室的操作水平。2.负责抽样的督导员（再次复验者），必须保证复检技术人员（初次复验者）不知道初检结果，以确保盲法复检真实性。3.按随机原则选出的涂片，无论涂片质量或镜检结果如何，都应包括在样本中，保证抽取的样本在统计学上真正代表被评估的实验室的总体水平。4.涂片初检结果与初次复验者盲法复检结果之间的分歧，由再次复验者复检后最终确定。5.被督导的实验室必须能够得到及时的复检结果反馈，以有利于涂片技术与质量的不断提高。（二）各级实验室盲法复检分工盲法复检需要一个有效的结核病实验室质控网络支持，网络中的各个实验室承担的工作如下：1.省参比室为再次复验者，负责实施地（市）和部分县级实验室涂片现场抽样，安排初次复验者之间的盲法复检；对涂片初检结果和盲法复检结果的分歧进行复检，并将质控结果及时反馈给被督导实验室和初次复验者。2.市（地）实验室承担初次复验者和再次复验者双重责任。作为初次复验者需完成省参比室下发涂片样本的盲法复检；作为再次复验者要负责实施县级实验室涂片样本现场抽样，安排初次复验者之间的盲法复检，对涂片初检结果和盲检结果的分歧进行复检，并将质控结果及时反馈给被督导实验室和初次复验者。3.县级实验室为初次复验者，负责完成市（地）实验室下发涂片样本的盲法复检，复检完成后，结果和涂片样本需及时上交。4.省参比室对市（地）级实验室的盲法复检，每半年应进行1次；市（地）级实验室对县级实验室的盲法复检，每季度进行1次。5.抽样由上一级实验室督导员现场评价时完成，或在国家规划人员进行常规督导时，可以完成痰涂片抽样的任务。（三）涂片样本量1.样本量估算：盲法复检的关键是复检结果能否真正代表被督导实验室的实际水平。世界卫生组织推荐80%灵敏度、100%特异性（针对阴性涂片）、误差为0的可接受数量以及95%可信限样本量表，可以极大地减少样本量，保证了盲法复检在统计学意义上可以代表被评估第25页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作实验室的总体水平（见表3）。表3样本量计算表上一年阴性涂片的总数30040050070010002000500010000200002.5%1852172432813183764234414505.0%1291431541671801972082132157.5%101108114121128135141142143涂片阳性率10.0%808689929610010310410413.0%67707175767980808215.0%59616265666869696918.0%505152545556575757说明：a涂片阳性率：指所有检测的涂片中阳性涂片的比例（平均阳性率）。b前一年阴性涂片总数：每年涂片的总数减去全年阳性涂片数。c抽样时，当上一年阴性涂片数量和涂片阳性率不在选择点，阴性涂片数值选择采用区间上限和涂片阳性率采用区间下限。2.保存样本量的要求：根据结核病实验室登记本记录，按照弃前留后的原则，保存近期3个月全部痰涂片待检（如果年涂片量不足500张，必须全部保存待检）。每次抽样后按照督导员的要求，再继续留存今后待查涂片。抽样后剩余痰涂片的销毁应在督导员监督下进行。（四）抽样量与抽样方法1.根据样本量表，核实被督导实验室“上一年阴性涂片数”和“涂片阳性率”，确定一年应复检的痰片量。如：该实验室前一年阴性涂片总数为3000张、涂片阳性率为9%，一年抽样复检涂片量为141张。2.确定本次现场涂片抽样量，如：按每季度计算应抽样36张，按每半年计算应抽样72张。第26页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作3.通过实验室登记本核实保存涂片数量并确定如何抽样，如：经核实上一季度留存涂片790张，用790/36=21.9，确定每隔22张选取一张涂片（不按实验室登记本序号抽取，按序号内实际检测涂片量计数选取）。4.根据以上计算，按实验室登记本选取涂片，如果抽样片丢失或损坏，选择下一张，如：实验序号93-3丢失，选择94-1；再从94-2开始计算间隔抽取下一张涂片。5.取出涂片按顺序摆放在玻片盒6.填写表二“复检质控记录”中实验室序号和自检结果，表三“初检质控记录”实验室序号。（五）复检步骤1.表4由再次复验者留存。在到达另一个实验室现场抽样时，将表5与抽样涂片同时交给该实验室（初次复验者），限期一个月完成盲法复检。如果抽检涂片是荧光染色，应先使用5%盐酸乙醇脱去荧光剂，再用萋尼氏染色法染色后，进行复检。2.再次复验者收到初次复验者交回的复检结果和抽样涂片后，核对盲法复检结果和表4中的初检结果，首先对两者间存在分歧的涂片进行复检，然后再复检10%涂片样品；肉眼观察部分以初次复验者结果为参考，全部重新复检，以再次复验者结果为准,并将最终结果记录在表6中。3.再次复验者完成复检后，填写表6“痰涂片盲法复检结果登记表”。表4再次复验质控记录镜检复验结果试验序号初检结果结果痰细胞（>10个/视野）大小肉眼观察厚薄染色脱落（<10%）受检单位：合计日期：负责人签名：第27页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作表5初次复验质控记录镜检复验结果试验序号结果痰细胞（>10个/视野）大小肉眼观察厚薄染色脱落（<10%）符合率日期：复验者签名：第28页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作表6痰涂片盲法复检结果登记表单位名称：质控次数登记日期初检结果（＋）（－）计初次复验单位复检结果（＋）（－）再次复验单位复检结果痰细胞涂抹大小合格数厚薄合格数染色合格数痰膜脱落合格数定性错误假阴假阳（＋）（－）合格数1234合计评价及建议：签名：日期：第29页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作（六）复检结果评价盲法复检不是为了验证单个病人诊断正确与否,而是评价整个实验室操作水平。评价的内容除了涂片镜检结果存在的误差之外，还包括涂片样品的质量（痰液与唾液的比例）、涂抹的大小和厚度、染色质量如何等,以便采取纠正措施，改善实验室工作质量。1.误差分类（1）定性错误包括高假阳性和高假阴性◆高假阳性（HighFalsePositive，HFP）：阴性片被错误地判读为2＋～4＋阳性。◆高假阴性（HighFalseNegative，HFN）：2＋～4＋阳性涂片被错误地判读为阴性。（2）定量错误包括量化误差、低假阳性和低假阴性◆量化误差（QuantificationError，QE）：同一张阳性涂片受检方和控制方阳性判断级别的差异。◆低假阳性（LowFalsePositive，LFP）：阴性涂片被错误地判断为低阳性（1＋以下）。◆低假阴性（LowFalseNegative，LFN）：低阳性（1＋以下）涂片被错误地判断为阴性。2.常见“误差”原因误差类型可能原因1)假象（例如着色沉淀或结晶）被误识为抗假阳性（FP）酸杆菌2)抗酸杆菌来自以前阳性涂片的镜油3)原始报告后着色的抗酸杆菌退色1）观察涂片的视野数量不足2）显微镜检查技术能力差假阴性（FN）3）染色操作不规范（抗酸杆菌颜色暗淡、背景对比不足或过高）4）显微镜存在问题5）染液质量查1）观察涂片时间不足量化误差（QE）2）阳性涂片的分级报告标准掌握差3）显微镜检查技术能力差4）显微镜存在问题1.2.3）对技术人员复训4）现场检查显微镜工作状态1、2、3）对技术人员复训4）现场检查显微镜5）重新购置质量合格的染料并重新配制染液建议1、2）对技术人员复训。3）对假阳性涂片重新着色并复检第30页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作（七）复检结果反馈1.盲法复检的最终目的是提高实验室涂片镜检的质量，必须按规定、持续和及时地向下级实验室反馈复检结果。2.复检发现的假阳性或假阴性涂片，由复检单位保存，以便最初的检验人员了解自己的失误，查找原因提高检测质量。3.初次复验者对最初的涂片结果并不清楚,应当将再次复验者的结果反馈给初次复验者，使其有机会了解自身水平。4.5.反馈内容应包括造成失误可能存在的原因，和技术改进建议。对存在严重误差（定性错误和频繁的定量错误）的实验室，再次复验者应及时反馈信息，并进行现场调查，协助查找原因解决问题。6.按统一要求填写反馈报告。盲法复检结果反馈报告受检单位：表7复检记录（按表4统计下列结果）初检结果阴性1～2条1＋2＋3＋4＋涂片数阴性1～2条复检结果1＋2＋3＋4＋表8统计误差：按表7统计高假阳性低假阳性高假阴性低假阴性量化误差合计评价与建议：第31页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作盲法复检举例：以某市结防机构，对县级结防机构现场抽样为例。步骤第一步根据上一年结核痰检情况，需了解：上一年镜检的所有涂片数、阴性涂片数、阳性涂片数举例实验室A县涂片数/年1534阳性片数/年224阴性片数/年1310步骤第二步计算每个实验室的阳性率（SPR）并精确至0.1%SPR=（每年的阳性涂片数/每年涂片总数）×100%最好根据上一年的实验室记录来计算应包括初诊和随访的所有涂片举例实验室A县涂片数/年1534阳性片数/年224SPR14.6%第32页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作步骤第三步根据表一：标本量计算表在表的左边，从表一行往下找到本县每年检测的阴性涂片的平均工作量。在表的顶端，找到本县相应的SPR。在表钟相应位置查出需抽检样本量的大小本例中全年阴性涂片数为1310张样本量表中选取阴性涂片2000张一栏本例中全年SPR为14.6%样本量表中选取SPR13.0%一栏抽检样本量＝79注：抽样时，当上一年阴性涂片数量和涂片阳性率不在选择点，阴性涂片数值采用区间上限，涂片阳性率采用区间下限举例步骤第四步确定抽取涂片的适宜的时间间隔如果按每年四次，则一季度一次。确定每次需抽检的涂片数举例74/4＝19.75即每个季度所需的涂片数为20步骤第五步根据实验室记录抽取标本按时间间隔季度内的涂片数，确定抽样间距若保存的涂片丢失，则选用下一张保存的涂片（不论结果如何）举例上一个季度保存的涂片数为384张。抽样间距的计算：384/20＝19.2则每隔19张涂片抽取一个样本第33页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作步骤第六步采用随机方法，确定抽样的第一张涂片抽样人员随机取出一张钱币，以钱币号码的最后两位数，作为抽取第一张涂片的序号。假定本例中第一张涂片序号为21举例步骤第七步抽取涂片举例以第21号涂片为第一张涂片，以后每间隔19张涂片抽取一张涂片，以下标虚线红圈的涂片，为第一张涂片，其它红圈为按间隔抽取的涂片。第34页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作实验室登记本第35页共40页《中国结核病防治规划―痰涂片镜检实验室质量保证手册》☆电子版LIBAIWA独家制作第八步：抽取完涂片后，将涂片交于同级实验室盲法复检，上级实验室对两者间存在分歧的涂片进行复检，然后再复检10%涂片样品；并根据误差分类表