PCR引物设计原则的5个要点

PCR引物设计原则的5个要点PCR引物设计原则PCR的首要任务就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物。设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和高效性。®®®®火度适引物长 引物GC 引物自身引物5’端可火度适度要适 含量要适 及引物之以修饰，3'宜 宜 间不应存端不可修饰在互补序

列PCR引物是人工合成的两段寡核甘酸。•个与感兴趣区域•端的•条DNA模板链互补，另一个与感兴趣区域另•端的另一条DNA模板链互补。PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。引物是PCR特异性反应的关键。引物设计要点（1）一般，引物的长度为15-23bp,常用的长度为18-21bp。过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq的进行反应。过短特异性差。物设计要点（2）引物3端的碱基一般不用A,因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。3,端防止连续三个C或G引物的GC含量一般为45-55%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。引物设计要点（3）碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。否则引物自身会折叠成人「一K或''',i.,从而影响引物与模板的复性结合。a、发夹结构（Hairpin）自身互补发夹结构b发夹结构b二聚体（Dimer）两个引物间互补引物1引物引物1引物25'在Taq酹的作用下从3'末端延伸形成二聚体引物设计要点（4）a）引物的5'端可以修饰，而3'端不可修饰b）引物的5'端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5'端修饰包括：加酹切位点,加标记荧光，引入点突变、插入突变、^失突变序列；引入启动子序列等.c）引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。在引物的5、端连接一对限制酶的识别序列，这样便于目的基因连接到载体上.双病切优点：使DNA片段能定向插入表达我体，防止自连JbNAffijW

双病切优点：使DNA片段能定向插入表达我体，防止自连JbNAffijW引物设计要点（5）退火温度高，扩增特异性强：退火温度低，扩增效率高。广如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，使DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4'C〜6°C不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的。（2020•江苏卷）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图所示（以EcoRI醒切为例）.请据图回答问题:I酶切EcoRI酶切EcoRI染色体DNA

fG：AATTC1

,Cri,AAjG,HI扩增|7如DNA聚金的……」 - .-PCR产物IV测序、分析|3,片段F的'■完整序列⑶若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤m选用的PCR引物必须是 （从引物①②③④中选择，填编号）.D、A序列（虚线处省略了部分核甘酸序列）己知序列5-AACTATOCCjCICATCjA (iCAATCiCGIAGCCTC1-31।।।।I।।।।।।।।।।। ।।।।।।।।।।। ।।1।3-TTGATACGCGAGTACT CGTT/XCGCATCGGAGA—5rPCX引物①5'—AACTATGCGCTCATGA—3'②