基因多态性与营养物质代谢课件

基因多态性人类基因多态性既来源于基因组中重复序列拷贝数的不同，也来源于单拷贝序列的变异。通常分为3大类：123限制性片段长度多态性，即由于单个碱基的缺失、重复和插入所引起限制性内切酶位点的变化，而导致DNA片段长度的变化。DNA重复序列的多态性，特别是短串联重复序列，如小卫星DNA和微卫星DNA，并主要表现于重复序列拷贝数的变异。单核苷酸多态性（SNPs），即散在的单个碱基的不同，包括单个碱基的缺失和插入，但更多的是单个碱基的置换。基因多态性人类基因多态性既来源于基因组1瘦素及瘦素受体基因多态性对营养物质代谢的影响瘦素及瘦素受体基因多态性对营养物质代谢的影响2Distribution

ofObesityintheworldObesityispopulararoundtheworldThepopulationsufferingfromitincreasesbytheyear

DistributionofObesePeopleCountry%America31.0Canada24.8Germany25.5England30.5Italy24.8Belgium18.6France20.6Greece27.0China19.7Japan25.2Korea27.2SouthAfrica22.3PercentageofObesityDistributionofObesityinthe3什么是瘦素（Leptin,LP)

What'sLeptin?瘦素是由肥胖基因编码的蛋白质激素,主要由脂肪组织合成,通过受体介导,作用于靶组织,抑制食欲并参与调节能量代谢、神经内分泌和免疫反应等。什么是瘦素（Leptin,LP)

What'sLep4瘦素的生物学特征主要由白色脂肪组织产生。其前体由167个氨基酸残基组成，N末端有21个氨基酸残基信号肽，该前体的信号肽在血液中被切掉而成为146氨基酸，分子量为16KD，具有强亲水性，以单体形式存在血浆中，通常血液浓度约为10-9g/ml。瘦素的生物学特征主要由白色脂肪组织产生。5瘦素的分泌规律

瘦素的分泌呈脉冲式，动物的体重、进食和饥饿状态可以影响脉冲的频率和幅度。瘦素mRNA表达呈日周期变化，夜间表达量最高。禁食使瘦素表达和分泌显著减少，同时日周期节律消失，再时食可使之恢复正常。瘦素的分泌规律

瘦素的分泌呈脉冲式，动物的体重、进食和饥饿6RegulationofLeptinLiverβ-CellStomachLeptinAdipocyteCNSFocusontheEffectinCentralNervousSystemLeptincancontroltheadipo-balanceofourbodythroughitsregulationondifferenttissuesRegulationofLeptinLiverβ-Cel7RegulationofLeptinAdipocyteBlood–BrainBarrierBloodVesselLeptinLeptinLeptinLeptinAndecreseinadipo-tissueMoreenergeexpenditureAppetiteinhibitionActivatingrelatedgeneTransittoBBBLeptinlevelriseAnincreaseinadipo-tissueHighfatstoresHighleptinlevelLowfatstoresLowleptinlevelANegative-FeedbackLooptomaintaintheadipo-balanceofbodyDynamic

EquilibriumCentralNervousSystemMuscleTissueMore

EnergyExpenditureRegulationofLeptinAdipocyte8SignalPathwayofLeptininCellLevelmembraneofhypothalamicneuronOBRbOBRbLeptinJAKSTATSTATPDNANucleus1138TyrP1138TyrPPPmRNASTATSTATPPLeptinbindstoOBRbOBRbisactivatedDimerizationofOBRbIsomerizationofJAKTyr1138andJAKarephosphorylatedTheSH2ofSTATbindstoTyr1138-PSTATisphosphorylatedDimerizationofSTATActivated-diSTATentersthenucleusActivatingthetranscriptionofrelatedgenesJAK

RelatedNeuropeptideSignalPathwayofLeptininCe9抑制食欲，减少能量摄取瘦素受体LRb二聚体介导JAKLRb活化磷酸化LRb吸引STAT3转运到细胞核附近磷酸化抑制弓状核mRNA表达NPY抑制食欲吸引JAK介导反馈抑制LRb信号结合抑制食欲，减少能量摄取瘦素受体LRb二聚体介导JAKLRb活10增加能量消耗，抑制脂肪生成瘦素神经中枢增加交感神经活性外周甲肾上腺激素增加脂肪细胞膜ß3受体激活去偶联蛋白合成增加能量变为热能能量消耗增加乙酰辅酶A羧化酶基因表达抑制脂肪生成活化AMPK抑制脂酰辅酶A羧化酶促进脂肪酸氧化增加能量消耗，抑制脂肪生成瘦素神经中枢增加交感外周甲肾增加脂11中国荷斯坦牛leptin基因多态性及其与产奶性能的关系徐凯勇中国荷斯坦牛leptin基因多态性及其与产奶性能的关系徐凯勇12研究目的意义运用PCR-RFLP和PCR-SSCP检测方法研究中国荷斯坦牛leptin基因多态性，获得该基因多态位点不同基因型，并计算群体中不同基因型的基因型频率，然后结合个体DHI数据，分析该基因多态性与产奶性能的关系。

（DHI:dairyherdimprovement,奶牛记录体系）研究目的意义运用PCR-RFLP和PCR-SSCP检13研究目的意义获得中国荷斯坦牛leptin基因中与产奶性能（产奶量、乳脂率、乳蛋白率、体细胞计数等）相关的遗传分子标记，为奶牛早期选种提供理论和技术上的参考。研究目的意义获得中国荷斯坦牛leptin基因中与产奶性能14补充PCR-RFLP聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析

限制性片段长度多态性(restrition

fragment

length

polymophism，RFLP):

是指由限制性酶切位点间的插入﹑缺失﹑重排或点突变所引起的基因型间限制性片段长度的变异。

PCR-RFLP:

是在PCR和DNA序列分析基础上产生的RFLP技术。该方法是通过PCR扩增一段DNA片段，然后再选择适当的限制性内切酶，消化PCR产物，经电泳，可得到有特异性的电泳谱带，从而达到鉴定不同基因型的目的。

补充PCR-RFLP聚合酶链式反应连接的限制性片段15PCR-RFLP引物特殊要求PCR产物的长度：200-1000bp酶切后产物片断的大小差距：100bp以上PCR-RFLP引物特殊要求PCR产物的长度：200-1016PCR-RFLP概念PCR-RFLP概念17单链构象多态性

(Single-StrandConformationPolymorphism，SSCP)

单链DNA片段呈复杂的空间构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会使其构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。

通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以将构象上有差异的分子分离开。称为单链构象多态性分析法。单链构象多态性

(Single-StrandConform18变性单链折叠电泳变性单链折叠电泳19材料1.实验样品的来源、采样方法及DHI数据

中国荷斯坦牛来自山东省济南市佳宝乳业有限公司第一牧场；

从1128头饲养管理相同且有完整DHI数据的产奶牛中，随机选则择年龄胎次相近的190头，乳静脉采血10mL，加入2mL酸性柠檬酸葡萄糖溶液（ACD）抗凝，-20℃保存。材料1.实验样品的来源、采样方法及DHI数据20材料2.主要仪器设备及实验试剂

dNTPsMixture、MgCl2、rTaqDNA聚合酶、10×PCRBuffer、DNA回收试剂盒、DNAMarkerDL2000、ClaⅠ酶切试剂等购自TaKaRa公司;

丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED等购自Amresco公司；

蛋白酶K等购自美国Promega公司；

琼脂糖等购自上海生工；Tris饱和酚等购自北京鼎国生物技术发展中心；Kpn2Ⅰ酶切试剂购自Fermentas公司。材料2.主要仪器设备及实验试剂21方法1.基因组DNA提取2.引物设计（1）牛leptin基因外显子2（EMBL，AY138588）E2FB引物序列，扩增后片段长度为320bp；（2）牛外显子2E2JW

引物序列引自Buchanan等（2002），扩增后片段长度为94bp。（3）牛leptin基因启动子（GenBank，AB070368）序列设计引物，扩增后片段长度为172bp。方法1.基因组DNA提取223.Leptin基因外显子2区多态性检测3.Leptin基因外显子2区多态性检测234.Leptin基因启动子区多态性检测PCR非变性聚丙烯酰胺凝胶银染条带基因型判定琼脂糖凝胶电泳条带切割回收测序4.Leptin基因启动子区多态性检测PCR24数据统计分析运用SAS8.2软件GLM程序，分析leptin基因外显子2区及启动子区多态位点不同基因型与乳脂率、乳蛋白率、体细胞计数及产奶量的关系，获得其最小二乘均值；同时考虑产犊季节、胎次及其与基因型的交互效应。数据统计分析运用SAS8.2软件GLM程序，分析25结果基因组DNA结果基因组DNA26Leptin基因外显子2区多态性检测结果Leptin基因外显子2区多态性检测结果27Leptin基因外显子2区多态性检测结果Leptin基因外显子2区多态性检测结果28Leptin基因启动子区多态性检测结果Leptin基因启动子区多态性检测结果29基因多态性与营养物质代谢课件30Leptin基因外显子2区多态性与产奶性能的关系Leptin基因外显子2区多态性与产奶性能的关系31Leptin基因外显子2区多态性与产奶性能的关系Leptin基因外显子2区多态性与产奶性能的关系32Leptin基因外显子2区多态性与产奶性能的关系Leptin基因外显子2区多态性与产奶性能的关系33Leptin基因外显子2区多态性与产奶性能的关系Leptin基因外显子2区多态性与产奶性能的关系34Leptin基因启动子

区多态性与产奶性能的关系Leptin基因启动子区多态性与产奶性能的关系35Leptin基因启动子

区多态性与产奶性能的关系Leptin基因启动子区多态性与产奶性能的关系36结论leptin基因启动子序列UASMS2和PSD可作为影响中国荷斯坦牛乳脂率和305天产奶量的遗传分子标记；外显子2区E2FB多态位点可以作为奶牛305天产奶量和乳脂率的一个遗传分子标记，E2JW多态位点可以作为提高奶牛乳蛋白率的一个遗传分子标记，而E2FB和E2JW两个多态位点交互作用共同影响305天产奶量。结论leptin基因启动子序列UASMS2和PSD37基因多态性人类基因多态性既来源于基因组中重复序列拷贝数的不同，也来源于单拷贝序列的变异。通常分为3大类：123限制性片段长度多态性，即由于单个碱基的缺失、重复和插入所引起限制性内切酶位点的变化，而导致DNA片段长度的变化。DNA重复序列的多态性，特别是短串联重复序列，如小卫星DNA和微卫星DNA，并主要表现于重复序列拷贝数的变异。单核苷酸多态性（SNPs），即散在的单个碱基的不同，包括单个碱基的缺失和插入，但更多的是单个碱基的置换。基因多态性人类基因多态性既来源于基因组38瘦素及瘦素受体基因多态性对营养物质代谢的影响瘦素及瘦素受体基因多态性对营养物质代谢的影响39Distribution

ofObesityintheworldObesityispopulararoundtheworldThepopulationsufferingfromitincreasesbytheyear

DistributionofObesePeopleCountry%America31.0Canada24.8Germany25.5England30.5Italy24.8Belgium18.6France20.6Greece27.0China19.7Japan25.2Korea27.2SouthAfrica22.3PercentageofObesityDistributionofObesityinthe40什么是瘦素（Leptin,LP)

What'sLeptin?瘦素是由肥胖基因编码的蛋白质激素,主要由脂肪组织合成,通过受体介导,作用于靶组织,抑制食欲并参与调节能量代谢、神经内分泌和免疫反应等。什么是瘦素（Leptin,LP)

What'sLep41瘦素的生物学特征主要由白色脂肪组织产生。其前体由167个氨基酸残基组成，N末端有21个氨基酸残基信号肽，该前体的信号肽在血液中被切掉而成为146氨基酸，分子量为16KD，具有强亲水性，以单体形式存在血浆中，通常血液浓度约为10-9g/ml。瘦素的生物学特征主要由白色脂肪组织产生。42瘦素的分泌规律

瘦素的分泌呈脉冲式，动物的体重、进食和饥饿状态可以影响脉冲的频率和幅度。瘦素mRNA表达呈日周期变化，夜间表达量最高。禁食使瘦素表达和分泌显著减少，同时日周期节律消失，再时食可使之恢复正常。瘦素的分泌规律

瘦素的分泌呈脉冲式，动物的体重、进食和饥饿43RegulationofLeptinLiverβ-CellStomachLeptinAdipocyteCNSFocusontheEffectinCentralNervousSystemLeptincancontroltheadipo-balanceofourbodythroughitsregulationondifferenttissuesRegulationofLeptinLiverβ-Cel44RegulationofLeptinAdipocyteBlood–BrainBarrierBloodVesselLeptinLeptinLeptinLeptinAndecreseinadipo-tissueMoreenergeexpenditureAppetiteinhibitionActivatingrelatedgeneTransittoBBBLeptinlevelriseAnincreaseinadipo-tissueHighfatstoresHighleptinlevelLowfatstoresLowleptinlevelANegative-FeedbackLooptomaintaintheadipo-balanceofbodyDynamic

EquilibriumCentralNervousSystemMuscleTissueMore

EnergyExpenditureRegulationofLeptinAdipocyte45SignalPathwayofLeptininCellLevelmembraneofhypothalamicneuronOBRbOBRbLeptinJAKSTATSTATPDNANucleus1138TyrP1138TyrPPPmRNASTATSTATPPLeptinbindstoOBRbOBRbisactivatedDimerizationofOBRbIsomerizationofJAKTyr1138andJAKarephosphorylatedTheSH2ofSTATbindstoTyr1138-PSTATisphosphorylatedDimerizationofSTATActivated-diSTATentersthenucleusActivatingthetranscriptionofrelatedgenesJAK

RelatedNeuropeptideSignalPathwayofLeptininCe46抑制食欲，减少能量摄取瘦素受体LRb二聚体介导JAKLRb活化磷酸化LRb吸引STAT3转运到细胞核附近磷酸化抑制弓状核mRNA表达NPY抑制食欲吸引JAK介导反馈抑制LRb信号结合抑制食欲，减少能量摄取瘦素受体LRb二聚体介导JAKLRb活47增加能量消耗，抑制脂肪生成瘦素神经中枢增加交感神经活性外周甲肾上腺激素增加脂肪细胞膜ß3受体激活去偶联蛋白合成增加能量变为热能能量消耗增加乙酰辅酶A羧化酶基因表达抑制脂肪生成活化AMPK抑制脂酰辅酶A羧化酶促进脂肪酸氧化增加能量消耗，抑制脂肪生成瘦素神经中枢增加交感外周甲肾增加脂48中国荷斯坦牛leptin基因多态性及其与产奶性能的关系徐凯勇中国荷斯坦牛leptin基因多态性及其与产奶性能的关系徐凯勇49研究目的意义运用PCR-RFLP和PCR-SSCP检测方法研究中国荷斯坦牛leptin基因多态性，获得该基因多态位点不同基因型，并计算群体中不同基因型的基因型频率，然后结合个体DHI数据，分析该基因多态性与产奶性能的关系。

（DHI:dairyherdimprovement,奶牛记录体系）研究目的意义运用PCR-RFLP和PCR-SSCP检50研究目的意义获得中国荷斯坦牛leptin基因中与产奶性能（产奶量、乳脂率、乳蛋白率、体细胞计数等）相关的遗传分子标记，为奶牛早期选种提供理论和技术上的参考。研究目的意义获得中国荷斯坦牛leptin基因中与产奶性能51补充PCR-RFLP聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析

限制性片段长度多态性(restrition

fragment

length

polymophism，RFLP):

是指由限制性酶切位点间的插入﹑缺失﹑重排或点突变所引起的基因型间限制性片段长度的变异。

PCR-RFLP:

是在PCR和DNA序列分析基础上产生的RFLP技术。该方法是通过PCR扩增一段DNA片段，然后再选择适当的限制性内切酶，消化PCR产物，经电泳，可得到有特异性的电泳谱带，从而达到鉴定不同基因型的目的。

补充PCR-RFLP聚合酶链式反应连接的限制性片段52PCR-RFLP引物特殊要求PCR产物的长度：200-1000bp酶切后产物片断的大小差距：100bp以上PCR-RFLP引物特殊要求PCR产物的长度：200-1053PCR-RFLP概念PCR-RFLP概念54单链构象多态性

(Single-StrandConformationPolymorphism，SSCP)

单链DNA片段呈复杂的空间构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会使其构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。

通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以将构象上有差异的分子分离开。称为单链构象多态性分析法。单链构象多态性

(Single-StrandConform55变性单链折叠电泳变性单链折叠电泳56材料1.实验样品的来源、采样方法及DHI数据

中国荷斯坦牛来自山东省济南市佳宝乳业有限公司第一牧场；

从1128头饲养管理相同且有完整DHI数据的产奶牛中，随机选则择年龄胎次相近的190头，乳静脉采血10mL，加入2mL酸性柠檬酸葡萄糖溶液（ACD）抗凝，-20℃保存。材料1.实验样品的来源、采样方法及DHI数据57材料2.主要仪器设备及实验试剂

dNTPsMixture、MgCl2、rTaqDNA聚合酶、10×PCRBuffer、DNA回收试剂盒、DNAMarkerDL2000、ClaⅠ酶切试剂等购自TaKaRa公司;

丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED等购自Amresco公司；

蛋白酶K等购自美国Promega公司；

琼脂糖等购自上海生工；Tris饱和酚等购自北京鼎国生物技术发展中心；Kpn2Ⅰ酶切试剂购自Fermentas公司。材料2.主要仪器设备及实验试剂58方法1.基因组DNA提取2.引物设计（1）牛leptin基因外显子2（EMBL，AY138588）E2FB引物序列，扩增后片段长度为320bp；（2）牛外显子2E2JW

引物序列引自Buchanan等（2002），扩增后片段长度为94bp。（3）牛leptin基因启动子（GenBank，AB070368）序列设计引物，