生物化学-第十章dna合成

第十章

DNA的生物合成（复制）

DNABiosynthesis,Replication

基因

（gene）基因是为蛋白质和RNA等生物活性分子编码的DNA功能片段根据产物的类别分为蛋白质基因和RNA基因根据产物的功能分为结构基因（酶和不直接影响其他基因表达的蛋白质）和调节基因（阻遏蛋白和转录激活因子）ReplicationReplicationTranscriptionReverseTranscriptionTranslation中心法则（thecentraldogma）JamesWatson

基因表达

（geneexpression）通过转录和翻译，将DNA分子上A，G，C，T四个符号所包含的遗传信息，转变为蛋白质分子上20种氨基酸的信息生物体内DNA合成的三个方面复制（replication）反转录（ReverseTranscription）损伤DNA的修复第一节

复制的基本规律

BasicRulesofDNAReplication复制的方式

——半保留复制（semi-conservativereplication）复制的高保真性（highfidelity）双向复制（bidirectionalreplication）半不连续复制（semi-discontinuousreplication）

一、半保留复制的实验依据和意义半保留复制的概念

DNA复制时，亲代DNA解开的两条单链各自作为模板，按碱基配对原则，合成与模板互补的DNA子链，成为两个与亲代DNA完全相同的子代DNA分子，在子代DNA分子中一条链是新合成的，另一条是保留亲代的，故称半保留复制。子链继承母链遗传信息的几种可能方式由Meselson和Stahl设计证明半保留复制的实验的被誉为生物学最美丽的实验Meselson和Stahl的证明DNA半保留复制的实验流程

半保留复制的意义

按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。

遗传的保守性，使物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。Meselson与Stalh在42年以后在最初他们相遇的一颗树下重逢时的合影二、双向复制

DNA复制时，是从起始点（origin）向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。1.复制起点（originofreplication)

原核生物仅一个；特殊的重复序列；约245bp。真核生物多个起始点2.复制叉复制时，亲代DNA开链，子链沿张开的模板生长，形成的Y形结构称为复制叉（replicationfork）。3.复制子（replicon）习惯上把两个相邻起始点之间的距离定位一个复制子。复制子是独立完成复制的单位。多个复制起点

三、半不连续复制

（semidiscontinuousreplication）在DNA复制过程中，一条链连续合成，称为领头链（前导链）。另一条链不连续合成，称为随从链（后随链）。冈崎片段：随从链不连续合成的DNA子链片段。这种领头链连续复制而随从链不连续复制的复制方式称为半不连续复制。半不连续复制第二节

DNA复制的酶学和拓扑学变化参与DNA复制的物质底物(substrate)：dATP,dTTP,dCTP,dGTP聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol模板(template):解开成单链的DNA母链引物(primer):提供3’-OH末端使dNTP可以依次聚合其他的酶、Mg2+和蛋白因子等。

一、复制的化学反应聚合反应的特点以DNA为模板，按碱基互补规律完成合成在RNA引物或DNA片段的3´-OH后接续进行，DNA单链聚合方向为5´→3´2个dNTP之间形成磷酸二酯键二、DNA聚合酶全称：依赖DNA的DNA聚合酶（DNA-dependent

DNA

polmerase

简称：DNA-pol活性：1.5’-3’的聚合活性

2.核酸外切酶活性ArthurKornberg大肠杆菌细胞蛋白质提取物+DNA模板有无DNA合成??-dNTPs-Mg2+(辅助因子)-ATP(能源)-游离的3’OH端(引物)体外测定DNA复制纯化得到DNA聚合酶I

目前是Standford大学医学院的终身教授（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-polIDNA-polIIDNA-polIII（1）DNA

pol5´3´的聚合作用，合成20个核苷酸即离开模板3´5´外切酶活性5´3´外切酶活性去除RNA引物，校正错误，修复损伤Klenow酶的晶体结构模型（2）DNApolⅡ只在缺DNApolⅠ、Ⅲ时起作用5´3´的聚合作用3´5´外切酶活性体内功能不清楚（3）DNA

polⅢ结构10种亚基共22个组成不对称二聚体α、ε、θ亚基组成核心酶β亚基结合模板并使酶沿模板滑动τ亚基与核心酶和模板的结合有关，有ATPase活性DNA-polIII的结构示意图功能5´3´的聚合作用（α亚基）3´5´外切酶活性（ε亚基）在DNA复制中主要作用

PolIPolⅡPolIII酶活性5´3´聚合作用+++3´5´外切酶活性+++5´3´外切酶活性+−−构成（亚基数）单体多个22个分子大小（×103）10990900体外链延长速度（核苷酸/分）600309000分子数/细胞40010-20功能修复合成不详复制切除引物填补空缺大肠杆菌中DNA聚合酶（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-polα：起始引发，有引物酶活性。DNA-polβ：参与低保真度的复制，无其它DNApol时起作用。DNA-polγ：在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-polδ：延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。DNA-polε：在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。αβγδε酶活性5´→3´聚合作用+++++3´→5´外切酶活性−−+++构成（亚基数）44425分子大小（×10³）30036-38160-300170250细胞内定位核核线粒体核核抑制作用双脱氧胸苷−++弱弱真菌二类萜烯+−−++功能引发修复复制复制修复（二）真核生物的DNA聚合酶三、

复制保真性的酶学依据复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。复制保真性的酶学机制：（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读（二）复制的保真性和碱基选择（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读（二）复制的保真性和碱基选择DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制1.遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3.复制出错时DNA-pol的及时校读功能。四、复制中的解链和

DNA分子的拓扑学变化（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白

原核生物复制起始的相关基因解螺旋酶（helicase）

——利用ATP功能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链引物酶（primase）

——复制起始时催化生成RNA引物的酶单链DNA结合蛋白（singlestrandedDNAbindingprotein,SSB）

——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整解螺旋酶ATP供能解开DNA双链rep蛋白=DnaB解螺旋酶IIⅢ5´3´3´5´DnaA辨认起始点DnaB解开DNA双链DnaC运送和协同DnaB引物、引发酶引物（primer）以DNA为模板，由5´3´合成十几到几十个核苷酸的RNA小片段。引物酶（primase）催化RNA引物的合成。

E.coli中称DnaG蛋白，由dnaG编码，对利福平不敏感。单链结合蛋白（

SSB）

与解开的DNA单链结合，保护、稳定单链DNA（二）DNA拓扑异构酶（DNAtopoisomerase)DNA复制时松弛超螺旋，以利复制叉的行进及DNA合成，合成后再使其恢复成超螺旋。拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键分类拓扑异构酶I

拓扑异构酶II（1）拓扑异构酶I（TopoI）切开双链环状DNA的一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。（2）拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。五、DNA连接酶（ligase）使相邻的DNA片段，以3´,5´-磷酸二酯键相连，需ATP或NAD+。它连接碱基互补配对基础上的双链DNA中的缺口。DNA连接酶的作用机理

第三节

DNA生物合成过程

（TheProcessofDNAReplication）

一、原核生物的DNA合成（一）复制的起始

1.DNA解开成单链，提供模板。

2.合成引物，提供3’-OH末端。DnaA辩认并结合到模板链OriC，DnaB、DnaC结合DnaA形成引发前体复合物，从OriC解开双链。SSB固定单链，形成复制泡。泡两端为复制叉。双链解开一定长度后DnaA脱落。1.DNA解链大肠杆菌DNA复制起始区的结构

2.引发体形成引发前体结合于后随链，沿复制叉行进方向移动，在不同部位与引物酶间断结合，聚合为引发体。大肠杆菌DNA复制过程中引发体的形成

引发体沿模板链由3´→5´滑动中，引发酶催化NTP按5´→3´方向合成RNA引物。复制开始超螺旋DNA拓扑酶松弛解链酶解开双链SSB大肠杆菌DNA复制过程中复制体的形成

DNApolⅢ催化与模板链已配对结合的dNTP在引物3´-OH上接续形成第1个磷酸二酯键。TopoⅡ解开超螺旋，为继续解链和引发体继续沿模板链滑动创造条件。两个复制叉不断向前移动，DNA双向解链，双向复制。（二）复制的延长DNApolⅢ的不对称二聚体同时结合两条单链DNA模板，朝复制叉方向滑动，按模板链碱基顺序同时催化前导链和随从链的合成，新链延伸方向为5´→3´。大肠杆菌DNA复制的延伸

1.原核生物复制的终止2.不连续片段的连接。（三）复制的终止大肠杆菌DNA复制终止区的结构

子代DNA的分离

二、真核与原核生物DNA复制的比较

原核真核复制速度快慢起始点少多（复制子）引物几十b10个b冈崎片段1000~2000b100~200b主要复制酶PolIIIPol

，三、真核生物的端粒和端粒酶1.端粒（telomere）指真核生物染色体线性DNA分子末端的特殊结构。由末端单链DNA序列和蛋白质构成。末端DNA序列是多次重复的富含T、G碱基的短序列（人端粒含TTAGGG的短重复序列）。线性DNA复制的末端2.端粒酶（telomerase）（1）组成：RNA（150b，富含CxAy）蛋白质（反转录酶）（2）作用：与端粒3´端结合后，以其RNA为模板，经反转录延长端粒。端粒酶催化的爬行模型爬行模型（3）生物学意义合成端粒，保证染色体复制的完整性保护DNA双链末段免遭降解及相互融合可能和衰老、肿瘤的发生或防治有关第四节

逆转录和其他复制方式

ReverseTranscriptionandOtherDNA

ReplicationWays

一、逆转录

（reversetranscription）

以RNA为模板，4种dNTP为原料，在反转录酶催化下，合成DNA的过程。逆转录酶（reversetranscriptase）（1）三种活性RNA指导的DNA合成（RDDP）RNAaseHDNA指导的DNA合成（DDDP）（2）特点无3´5´和5´3´外切酶活需tRNA引物、Zn2+逆转录过程dNTPs引物

RNA模板RNA/DNA杂化双链

逆转录酶RNA

单链DNAdNTPs

逆转录酶双链DNA逆转录二、逆转录研究的意义补充了中心法则，并认识到RNA在生命过程中的重要性；发现了癌基因、原癌基因，深化了对RNA病毒致癌、致病机理的研究；利用逆转录酶，进行基因操作，构建cDNA文库，制备cDNA探针。三、滚环复制和D环复制滚环复制（rollingcirclereplication）是某些低等生物的复制形式，如φX174和M13噬菌体等。滚环复制

滚环复制D环复制（D-loopreplication）

是线粒体DNA（mitochondrialDNA,mtDNA）的复制形式。第五节

DNA损伤（突变）与修复

DNADamage(Mutation)andRepair

突变(mutation)

DNA分子中一个或多个碱基的构成、复制及表型功能的异常。即遗传物质结构改变引起遗传信息的改变，也称DNA损伤(DNAdamage)。进化的分子基础基因型改变（表型不变）致死性的突变（消灭病原体）某些疾病发病的分子基础一、突变的意义二、引发突变的因素自发突变

10-9（如脱嘌呤作用、脱氨基作用）物理因素

紫外线（T-T）、各种辐射化学因素诱变剂化学物类别作用点分子改变（从原型配对至突变型）碱基类似物5−溴尿嘧啶（5−BU）A→5−BU→G（被取代）-A--G--G-→→-T--T--C-羟胺类（NH2OH）T→C-T--C--C-→→-A--A--G-亚硝酸盐（NO2

−）C→U-G--G--A-→→-C--U--T-烷化剂（如氮芥类）G→GCH3（G碱基N-7位甲化）DNA缺失G常见的化学诱变剂三、突变分子改变的类型

错配（mismatch）缺失（deletion）

框移（frame-shift）插入（insertion）重排（rearrangement）（一）错配DNA分子上的碱基错配称点突变（pointmutation）1.转换发生在同型碱基之间。即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。2.颠换发生在异型碱基之间。即嘌呤代替嘧啶，或嘧啶代替嘌呤。CTCGAGGTGCACHbA基因肽链

N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu---C1234567…..

镰刀型红细胞贫血HbSN-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu---C1234567……（二）缺失、插入和框移……GCA

GUA

CAU

GUC……

丙缬组缬

缺失C……GAG

UAC

AUG

UC…..

谷酪蛋丝δβγ1γ2δδββδδβγ1γ1γ2γ2（三）重排由基因重排引起的两种地中海贫血基因型Hbβ基因家族H