第6章抗生素的生物合成课件

第六章抗生素的生物合成

及产生的遗传学

.第六章抗生素的生物合成

及产生的遗传学.1第一节研究方法

完整地阐明生物合成过程应包括：(1)促成分子建成的初级代谢物结构单元的确立。(2)代谢途径中中间产物的分离；这些产物的结构可能会提供关于反应次序问题的合理假设。(3)催化每一个反应的酶的鉴定。(4)操纵基因及其序列和组成的确定。.第一节研究方法完整地阐明生物合成过程应包括：.2一、追踪技术为确定相应的结构单元，将所设想的抗生素前体用14C，3H或13C等同位素标记，再将其加入到产生菌的培养物中，最好是在生长后期加入。经过一段时间的培养后，提取其中相应的抗生素，纯化，检测所掺入的同位素。在使用放射性同位素进行标记的过程中，常常需要对分子进行化学降解，以确定放射性同位素所掺入的组成该分子的原子。.一、追踪技术为确定相应的结构单元，将所设想的抗生素前体用14313C标记前体在利用13C标记前体时，掺入单个原子的情况可以通过产物的核磁共振(NMR)光谱来显示。利用这项技术，分子中单个碳原子在共振光谱中以高峰出现，其高度与其中13C的含量几乎成正比。标记物的渗入度可由所标记分子的峰值与天然产物的峰值之比来表示(13C的天然富足度为1.1％)。.13C标记前体在利用13C标记前体时，掺入单个原子的情况可以42-13C标记的乙酸掺入替考拉宁(A)通过常规发酵得出的替考拉宁13C-NMR光谱(δ20-125ppm带)；(B)通过[2-13C]标记的乙酸掺入发酵所得出的替考拉宁的光谱。可以看出，乙酸是二羟苯甘氨酸部分(小圆点)和脂肪酸链(大圆点)的前体物质。.2-13C标记的乙酸掺入替考拉宁(A)通过常规发酵得出的替52H标记前体物分子中两个相邻的原子对核磁共振光谱峰及其偶合常数的多重性的高分辨分析，可以揭示出两个原子是否在整个代谢过程中都连结在一起，还是保持相对独立，或是通过不同的代谢途径掺入的。通过利用氘标记的前体物的NMR的研究，同样可以获取重要的信息。与氢不同，氘在NMR中不会产生质子的共振信号。在生物合成反应机制的研究中，氘作为一种特殊的标记物质，在生物合成过程的反应位点上取代单个或多个氢原子。在菌株培养过程中，这些中间产物则转变为终产物分子。终产物分子的质子NMR可以显示在酶促反应中，该原子是否被保留或被取代。.2H标记前体物分子中两个相邻的原子对核磁共振光谱峰及其偶合常6二、中间代谢物的鉴定生物合成反应中某一步反应不能进行的突变株的分离，是用来鉴定合成途径中某些中间产物的一种普遍采用的适宜手段。这些被称为“阻断变株”的突变体，常导致培养基中那些无法参与下一步反应的底物的积累。阻断变株可通过对产生菌进行诱变处理，然后分离出那些不具有产生抗生素能力的菌落而获得。将这些变株一次两个在同一摇瓶内培养，发酵液进行抗菌活性的测定。.二、中间代谢物的鉴定生物合成反应中某一步反应不能进行的突变株7两种不同的突变株进行共培养突变株单独培养时不能产生抗生素，但将两种不同的突变株进行共培养时，则可以产生抗生素，表明这两种突变株的突变发生在生物合成途径中的两个不同的阶段。其中一种变株所不能合成的中间物，可由另一种能积累该中间物的变株所提供，从而使抗生素合成的一系列反应得以进行。.两种不同的突变株进行共培养突变株单独培养时不能产生抗生素，但8所积累的产物可以被分离和鉴定为证实这些产物的确是生物合成途径的中间产物，可以通过原始出发菌株，由这些中间产物转变为终产物的实验以进行评价。例如，我们可以将中间产物加入到产生菌的细胞悬浮物中，几小时后，测定其中抗生素的生成量，再与对照组中合成抗生素的量进行比较。

.所积累的产物可以被分离和鉴定为证实这些产物的确是生物合成途径9三、酶的鉴定通过比较产抗生素株与不产抗生素变株中酶的活力，有时可以获取有关生物合成途径的一些信息。产抗生素株中一种酶活力的存在，与阻断变株中该酶的缺失，即可有力地证明这种酶在该生物合成途径中起着重要的作用。在示踪技术和中间物的分离技术为生物合成次序的确定提供足够信息的基础上，有可能从酶的角度来研究单个合成反应。.三、酶的鉴定通过比较产抗生素株与不产抗生素变株中酶的活力，有10四、遗传学与重组DNA技术在过去几年里，由于有关基因的克隆分析等一系列技术的应用，使次级代谢过程的生物合成和调节机制的研究取得了很大进展。最初的研究发现，生物合成基因通常在染色体上成簇存在，在放线菌中尤其是这样。进一步研究又发现，在通常情况下，这些基因簇还包括调节基因和自身抗性基因。.四、遗传学与重组DNA技术在过去几年里，由于有关基因的克隆分11确定生物合成基因两种不同策略1．将某种抗生素产生菌(通常指放线菌)的其中一个基因文库转入到对该抗生素敏感的菌株中，筛选抗性克隆。从这些抗性克隆中分离出编码自身抗性的基因，然后可以着手分离侧翼的结构基因。2．利用在相类似的生物合成途径中功能相似的基因通常具有的高度的同源性，可将相类似的生物合成途径的基因进行杂交。生物合成基因确定后，将其核苷酸序列与数据库中已知的序列进行比较，可以揭示出基因产物的功能和特性，即其酶促作用和调节机能。而且，所推断的酶的氨基酸序列可能有助于我们了解生物合成反应的机制。.确定生物合成基因两种不同策略1．将某种抗生素产生菌(通常12第二节

生物合成反应与途径合成抗生素的酶促反应与生成初级代谢产物的中间代谢并非有根本的不同。事实上，催化特殊代谢物合成的酶是由普通代谢中的酶进化而来。

.第二节生物合成反应与途径合成抗生素的酶促反应与生成初级代谢13抗生素生物合成的途径可分两大类１．对初级代谢产物的修饰反应。这类反应与初级代谢物的合成与分解反应相类似，例如象氨基酸或核苷酸的代谢反应。这些反应的产物可以是一种抗生素，或者是一种结构较为复杂的抗生素的组成成分。在初级代谢物中，有的分子由两个或两个以上的单位组成，如叶酸或辅酶A等。2．相似代谢物的聚合。通过这些反应，通常是先形成复杂而又关键的中间物，然后经过进一步修饰，生成具有活性的终产物分子。.抗生素生物合成的途径可分两大类１．对初级代谢产物的修饰反应。14叶酸蝶啶焦磷酸酯对氨基苯甲酸谷氨酸对氨基苯甲酰谷氨酸蝶啶焦磷酸酯.叶酸蝶啶焦磷酸酯对氨基苯甲酸谷氨酸对氨基苯甲酰谷氨酸蝶啶焦磷15相似代谢物的聚合(1)来源于聚酮体合成的抗生素。其聚合反应机制与脂肪酸合成反应的机制相类似。(2)肽类抗生素，由氨基酸缩合而成，其过程与聚酮体合成的过程相似。(3)类异戊二烯类抗生素，由多个异戊二烯单位缩合而成。(4)氨基糖苷类抗生素，由多个糖单位聚合而成，类似于多糖的合成过程。.相似代谢物的聚合(1)来源于聚酮体合成的抗生素。其聚合反应机16一、初级代谢与次级代谢的关系次级代谢物的大量生成与细胞的初级代谢相比发生了相当大的变化。这种变化体现在要为次级代谢物的生成提供物质和能量(ATP)以及还原性辅酶。将产抗株(尤其是高产突变株)与不产抗株作比较，二者中与抗生素生物合成并无直接关系的酶的水平也可能存在实质性的不同。.一、初级代谢与次级代谢的关系次级代谢物的大量生成与细胞的初级17二、抗生素“家族”的合成一个微生物株系常常会产生几种代谢物，这些代谢物在其化学结构与生物学活性上相类似，因而共同组成一个抗生素“家族”。家族化合物的生成并不仅仅局限于抗生素类，而是次级代谢的一个普遍特征，这一特征归因于酶对相应底物缺乏特异性。事实上，酶通常只识别底物分子的特异区。结构非常相似的比较大的分子，在与酶促作用位点无空间关系的区域内，存在一些细小的差异。这些大分子物质在相应的反应中，会被酶当作底物而识别。

.二、抗生素“家族”的合成一个微生物株系常常会产生几种代谢物，18抗生素家族的合成是由下列因素决定的1.关键中间物通过上述某种途径而合成。2.这一中间物通过通常的代谢反应修饰，如甲基化作用、羟基化作用等等。3.同一种代谢物可以是能生成两种或两种以上产物的几种反应的底物，这两种或两种以上的产物能被转化，因而形成代谢树(metabolictree)。4.由于底物明显缺乏特异性，同样的代谢物可通过两种不同顺序的反应而合成。由此形成代谢网(metabolicnet)。.抗生素家族的合成是由下列因素决定的1.关键中间物通过上述某种19第三节

初级代谢产物向抗生素或抗生素组成部分的转化

一、与氨基酸代谢有关的生物合成途径二、与核苷酸代谢有关的生物合成途径三、与辅酶代谢有关的生物合成途径.第三节初级代谢产物向抗生素或抗生素组成部分的转化一、与20一、与氨基酸代谢有关的生物合成途径一些抗生素，或一些大分子抗生素的组成部分，来源于氨基酸合成代谢或分解代谢的中间产物。

.一、与氨基酸代谢有关的生物合成途径一些抗生素，或一些大分子抗21

氯霉素的生物合成对氨基苯丙酮酸转氨基氧化还原羟基化由分离阻断变株全部中间产物的方法酶已被鉴定.氯霉素的生物合成对氨基苯丙酮酸转氨基氧化还原羟基化由22安莎霉素和丝裂霉素C的生物合成中关键的中间物的合成途径这种产物的一个与众不同的特征，是有一个氨基出现在苯甲酸羧基的间位上(在初级代谢中只有对位或邻位氨基苯甲酸)。312123-H2O-H2O重排关键的中间物.安莎霉素和丝裂霉素C的生物合成中关键的中间物的合成途径这种产23林可霉素中脯氨酰部分形成的过程酪氨酸羟基化

环化氧化,环化酰胺化

氨基酸分解代谢的例子.林可霉素中脯氨酰部分形成的过程酪氨酸羟基化环化氧化,环24氨基酸的β位羟基化次级代谢的一个典型反应是氨基酸的β位羟基化。对氨基苯丙氨酸的β位羟基化是氯霉素生物合成第一阶段反应中的一个反应。β－羟化氨基酸作为几种抗生素分子的组成成分而存在；而在糖肽类抗生素及诺卡菌素中的对羟基苯甘氨酸，则是由酪氨酸经过β位羟基化所引发的一系列反应生成的。.氨基酸的β位羟基化次级代谢的一个典型反应是氨基酸的β位羟基化25克拉维酸的生物合成途径

精氨酸环化β位羟基化环化.克拉维酸的生物合成途径精氨酸环化β位羟基化环化.26二、与核苷酸代谢有关的生物合成途径具有核苷类结构的抗生素是经过与核苷酸合成有关的途径，或通过常见核苷的修饰作用而生成的。

.二、与核苷酸代谢有关的生物合成途径具有核苷类结构的抗生素是经27核苷酸合成的途径1.从头合成。2.通过一种称为“补救途径”的方式合成。这种补救途径包括外源嘌呤或嘧啶碱基的核糖基化作用。有几种抗生素是从修饰常见的核苷或核苷酸而生成的。.核苷酸合成的途径1.从头合成。.28阿糖腺苷的合成

氧化还原烯醇化酮基阿糖腺苷是通过2’－羟基腺苷的差向异构比作用而合成.阿糖腺苷的合成氧化还原烯醇化酮基阿糖腺苷是通过2’－羟基29嘌呤霉素的生物合成腺嘌呤核苷3’—氨基—3’—脱氧腺苷氨基化酪氨酸酰胺化乙酰化N-甲基化O-甲基化去乙酰化嘌呤霉素失活作用.嘌呤霉素的生物合成腺嘌呤核苷3’—氨基—3’—脱氧腺苷氨基30三、与辅酶代谢有关的生物合成途径叶酸中的蝶啶部分及核黄素的合成，是以甲酸的形式，将鸟嘌呤核苷三磷酸第八位碳去掉，以此起始经一系列反应完成的。核苷类抗生素，包括一些杀结核菌素，如丰加霉素与蝶啶生物合成的相似性。核糖是完成蝶啶和抗生素分子两者合成所需要的三个碳原子的供体。.三、与辅酶代谢有关的生物合成途径叶酸中的蝶啶部分及核黄素的合31推断中的丰加霉素的生物合成鸟嘌呤核苷三磷酸187936GTP－甲酰水解酶7—脱氮—腺嘌呤环三磷酸核糖.推断中的丰加霉素的生物合成鸟嘌呤核苷三磷酸187936GTP32第四节

来源于聚酮体合成的抗生素相当数量的抗生素是通过称为聚酮体合成的过程生成的，该过程与初级代谢中脂肪酸的合成密切相关。.第四节来源于聚酮体合成的抗生素相当数量的抗生素是通过称为33脂肪酸的合成脂肪酸的合成是脂肪酸合成酶(FAS)所催化的一个聚合反应过程。在脊椎动物和酵母中，FAS是含有两个亚基(I型FAS)的大的多功能酶；而在细菌和较高等的植物中，则是一个多酶复合体，可被分解为七个以上不同的酶(II型FAS)。.脂肪酸的合成脂肪酸的合成是脂肪酸合成酶(FAS)所催化的一个34脂肪酸聚合反应的几个必要的步骤(1)作为乙酸起始物分子和作为丙二酸延长单位与合成酶如硫脂酶相连接：乙酸与缩合酶亚基(或区域)相连接，而丙二酸与酰基载体蛋白(ACP)相连接。(2)乙酸中的羧基碳缩合成丙二酸的亚甲基碳；与此同时，丙二酸的自由羧基以CO2的形式失去，形成乙酰乙酸，在硫脂酶作用下与ACP相连接。(3)乙酰乙酸中的酮基被还原为羟基。随后脱水产生一个双键，该双键在第二步还原反应中被饱和生成丁酸酯部分。(4)延伸中的链被转移到缩合酶，另一个丙酸单位与ACP连接，反应重复进行，直至达到适合的链长。由硫脂酶将该脂肪酸释放出去。.脂肪酸聚合反应的几个必要的步骤(1)作为乙酸起始物分子和作为35脂肪酸聚合反应的示意图1234.脂肪酸聚合反应的示意图1234.36微生物中脂肪酸的合成模式在微生物中，这一生物合成模式有些不同：在芽胞杆菌属和几种放线菌属中，起始物分子常为小的分支的脂肪酸，并且还形成15～17个碳的分支脂肪酸。另外，还常伴随有一步还原反应被省掉，形成线性不饱和脂肪酸。.微生物中脂肪酸的合成模式在微生物中，这一生物合成模式有些不同37聚酮类抗生素合成的聚合反应不同点聚酮类抗生素合成的聚合反应过程还由两种类型的合成酶所催化：多功能酶I型聚酮亚甲基合酶(PKSI)和多酶复合物II型聚酮亚甲基合酶(PKSII)。与FASs不同的是，这两种类型的酶在同一个属的一些菌株中均存在。.聚酮类抗生素合成的聚合反应不同点聚酮类抗生素合成的聚合反应过38一、芳香族聚酮类抗生素许多由放线菌或丝状真菌产生的抗生素都有一个多元芳香环结构，或者来源于多元芳香环中间物。控制合成的基因编码具有II型PKS特征的蛋白。这些蛋白在结构和功能上与II型FAS相似，但是缺少上述脂肪酸合成第3点中使酮基还原的亚基。聚合反应的产物是一个聚酮亚甲基链(聚酮体)，即酮基与亚甲基相互更换的一个线性分子。这个链具有很高的反应活性，并趋向于通过酮基与亚甲基的醛醇缩合作用而折叠成环。根据链的长度与参与其中酶的特性由立体空间和能量所决定，导致形成许多由芳香环组成的不同的结构。.一、芳香族聚酮类抗生素许多由放线菌或丝状真菌产生的抗生素都有39

四环素的生物合成丙二酰胺醛醇缩合氧化氧化氨基化甲基化羟基化还原,烯醇化.四环素的生物合成丙二酰胺醛醇缩合氧化氧化氨基化甲基化羟基40

灰黄霉素的生物合成氯化甲基化还原环化.灰黄霉素的生物合成氯化甲基化还原环化.41二、聚酮体抗生素的生物合成有几种类型的抗生素的生物合成涉及小分子羧酸的聚合，其机制与脂肪酸合成有关，然而在许多重要的方面都与后者相异。.二、聚酮体抗生素的生物合成有几种类型的抗生素的生物合成涉及小42与脂肪酸合成的差异1.起始物通常是丙酸，但有时也包含其他脂肪酸或芳香族酸类。2.较常见的延长分子是甲基丙二酸。若甲基丙二酸是延长单位，结果所得到的链状分子中就带有甲基取代基。若是乙基丙二酸，则得到的是乙基取代基。因为延长中的链的缩合总是发生在羰基的邻位碳上。3.省略了脂肪酸合成的第三点的还原步骤。.与脂肪酸合成的差异1.起始物通常是丙酸，但有时也包含其他脂43与芳香族聚酮类的差异链状分子中可能存在酮基或羟基功能团或双键结构。因为烷基取代基的存在，链状分子中不含有这一系列由相邻酮基激活的亚甲基，因而不能经由简单的脱水反应而形成芳香环。最终的结构只能是链状分子或由酰胺键连接的大型环状分子(大环内酰胺)，或是酯键连接的大型环状分子(大环内酯)。.与芳香族聚酮类的差异链状分子中可能存在酮基或羟基功能团或双键44聚酮体抗生素生物合成基因生物合成基因都包含一个或多个被称为合酶单位(SU)的区域。每一个SU组成了一个具有类FAS活性的区域，这种活性对完成一个完整的延长过程是必需的，这包括选择延长单位，缩合过程、并且在恰当的时候对全部或部分醛基进行还原。在一个循环完成后，新生成的聚酮体被转移到邻近的合酶单位上，在此处加上另外一个延长单位并继续进行。因此，SU排列的顺序决定功能基因最终产物的顺序，SU的数目决定链的长度。.聚酮体抗生素生物合成基因生物合成基因都包含一个或多个被称为合45组成红霉素骨架的分子链顺序的构建6-去氧红霉内酯BI型聚酮亚甲基合酶甲基丙二酸丙酸缩合，还原缩合缩合缩合，还原缩合，还原缩合，还原.组成红霉素骨架的分子链顺序的构建6-去氧红霉内酯BI型聚酮亚46链状分子的基本结构及其酶促折叠情况决定了最终的抗生素属于哪一类型14和16大环内酯抗生素具有26至28原子的多聚烯烃安莎霉素类(大环内酰胺)每一类型中都有大量的抗生素是因不同产生菌的其他生物合成基因的特异性而产生的。.链状分子的基本结构及其酶促折叠情况决定了最终的抗生素属于哪一47红霉素A过程的生物合成反应的次序6-羟基化5-去氧糖胺3-红霉糖甲基化12-羟基化甲基化.红霉素A过程的生物合成反应的次序6-羟基化5-去氧糖胺3-红48利福霉素B生物合成主要步骤酰胺化,羟基化羟基化甲基化,乙酰化,插氧乙酸化在利福霉素B的结构中，碳链被插入其中的氧原子所打断。.利福霉素B生物合成主要步骤酰胺化,羟基化羟基化甲基化,乙49第五节

来源于氨基酸聚合反应的抗生素

.第五节来源于氨基酸聚合反应的抗生素.50一、硫代模板机制有很大数量的微生物经由硫代模板机制的过程合成肽类抗生素。即抗生素分子中氨基酸残基的顺序，是由前体(例如硫酯)与具有催化聚合反应作用的一个或多个多功能的特异位点相连接的顺序所决定的。.一、硫代模板机制有很大数量的微生物经由硫代模板机制的过程合成51硫代模板机制基本的过程(1)氨基酸活化为腺嘌呤核苷酸；(2)氨基酸缩合至酶上的含硫基团；(3)逐步聚合。.硫代模板机制基本的过程(1)氨基酸活化为腺嘌呤核苷酸；.52聚合作用示意图形成肽键的能量由硫酯键的断裂来提供。.聚合作用示意图形成肽键的能量由硫酯键的断裂来提供。.53催化酶的复合物催化整个过程的酶复合物由四种以上多功能酶所组成。由编码基因的顺序所决定的氨基酸顺序，揭示了在每一个酶中存在单元(module)，其数目与该酶催化氨基酸的数目相当。在每一个单元中，存在完成一个延长循环不同过程中的功能区（氨基酸的活化，含硫基团的酯化和肽键的形成）。在这些单元中，存在催化由L型氨基酸向D型氨基酸的异构化，或酰胺键氮原子的甲基化等功能。.催化酶的复合物催化整个过程的酶复合物由四种以上多功能酶所组成54短杆肽S的生物合成－NH2COOHCOSEnz异构化活化－NH2－NH2硫酯酶.短杆肽S的生物合成－NH2COOHCOSEnz异构化活化55异青霉素N的生物合成异青霉素N是青霉素、头孢菌素和头霉素生物合成的共同前体。D异青霉素N合成酶δ－氨基己二酸－半胱氨酸－D－缬氨酸.异青霉素N的生物合成异青霉素N是青霉素、头孢菌素和头霉素生物56β－内酰胺类抗生素生物合成异青霉素N.β－内酰胺类抗生素生物合成异青霉素N.57第七节

寡糖类抗生素很重要的一类寡糖类抗生素是氨基糖苷类抗生素，由几个糖单位和一个氨基环醇组成。氨基糖苷完全是对通过对普通糖类的修饰衍生而来的，例如葡萄糖苷或氨基葡萄糖。糖类的修饰作用有两种类型：正常糖分子首先被转变成生物合成中间体，然后进一步装配。或者它们先被装配，然后进行修饰。.第七节寡糖类抗生素很重要的一类寡糖类抗生素是氨基糖苷类抗58糖的修饰或聚合发生在糖被激活之前在初级代谢中，多糖是通过在异端碳上被激活为二磷酸核苷的糖类分子的逐步缩合而形成的。在氨基糖苷的生物合成中，糖的前体在被修饰或聚合之前必需先活化，转化为其二磷酸核苷衍生物。.糖的修饰或聚合发生在糖被激活之前在初级代谢中，多糖是通过在异59一、氨基环醇的生物合成大多数具有治疗作用的氨基糖苷类抗生素作为特征性氨基环醇都含有2－脱氧链霉胺或链霉胍。尽管它们都是由葡萄糖衍生而来，且结构也相似，但这两种分子是经由不同的途径合成的。.一、氨基环醇的生物合成大多数具有治疗作用的氨基糖苷类抗生素作60链霉素和2－脱氧链霉胺的结构2－脱氧链霉胺链霉胍N-甲基葡糖胺葡糖胺.链霉素和2－脱氧链霉胺的结构2－脱氧链霉胺链霉胍N-甲基葡糖61链霉胍的生物合成途径氧化5青蟹肌醇单酮转氨基化青蟹肌醇胺精氨酸转氨基化精氨酸D-葡萄糖氧化.链霉胍的生物合成途径氧化5青蟹肌醇单酮转氨基化青蟹肌醇胺622-脱氧链霉胺的生物合成

葡萄糖－6－磷酸P转氨基化氧化转氨基化.2-脱氧链霉胺的生物合成葡萄糖－6－磷酸P转氨基化氧化63二、氨基糖苷类抗生素合成示例1.链霉素2.庆大霉素.二、氨基糖苷类抗生素合成示例1.链霉素.64链霉素的结构N-甲基-L-葡萄糖胺链霉胍链霉糖.链霉素的结构N-甲基-L-葡萄糖胺链霉胍链霉糖.65链霉素分子装配分两步第一步反应是将活化为脱氧胸腺嘧啶核苷二磷酸的二氢链霉糖加至磷酸链霉胍上。第二步是将N－甲基－L－葡萄糖胺加至伪双糖上。.链霉素分子装配分两步第一步反应是将活化为脱氧胸腺嘧啶核苷二磷66链霉素的生物合成

dTDP-葡萄糖脱水dTDP－4－酮－1－鼠李糖差向异构化dTDP—二氢链霉糖合成酶3氧化dTDP＝脱氧胸腺嘧啶核苷二磷酸

.链霉素的生物合成dTDP-葡萄糖脱水dTDP－4－酮－167庆大霉素族抗生素的合成

D－葡萄糖胺D－木糖2－脱氧链霉胺甲基化，甲氨基化氨基化脱水甲基化还原先被装配，后修饰.庆大霉素族抗生素的合成D－葡萄糖胺D－木糖2－脱氧链霉68第六章抗生素的生物合成

及产生的遗传学

.第六章抗生素的生物合成

及产生的遗传学.69第一节研究方法

完整地阐明生物合成过程应包括：(1)促成分子建成的初级代谢物结构单元的确立。(2)代谢途径中中间产物的分离；这些产物的结构可能会提供关于反应次序问题的合理假设。(3)催化每一个反应的酶的鉴定。(4)操纵基因及其序列和组成的确定。.第一节研究方法完整地阐明生物合成过程应包括：.70一、追踪技术为确定相应的结构单元，将所设想的抗生素前体用14C，3H或13C等同位素标记，再将其加入到产生菌的培养物中，最好是在生长后期加入。经过一段时间的培养后，提取其中相应的抗生素，纯化，检测所掺入的同位素。在使用放射性同位素进行标记的过程中，常常需要对分子进行化学降解，以确定放射性同位素所掺入的组成该分子的原子。.一、追踪技术为确定相应的结构单元，将所设想的抗生素前体用147113C标记前体在利用13C标记前体时，掺入单个原子的情况可以通过产物的核磁共振(NMR)光谱来显示。利用这项技术，分子中单个碳原子在共振光谱中以高峰出现，其高度与其中13C的含量几乎成正比。标记物的渗入度可由所标记分子的峰值与天然产物的峰值之比来表示(13C的天然富足度为1.1％)。.13C标记前体在利用13C标记前体时，掺入单个原子的情况可以722-13C标记的乙酸掺入替考拉宁(A)通过常规发酵得出的替考拉宁13C-NMR光谱(δ20-125ppm带)；(B)通过[2-13C]标记的乙酸掺入发酵所得出的替考拉宁的光谱。可以看出，乙酸是二羟苯甘氨酸部分(小圆点)和脂肪酸链(大圆点)的前体物质。.2-13C标记的乙酸掺入替考拉宁(A)通过常规发酵得出的替732H标记前体物分子中两个相邻的原子对核磁共振光谱峰及其偶合常数的多重性的高分辨分析，可以揭示出两个原子是否在整个代谢过程中都连结在一起，还是保持相对独立，或是通过不同的代谢途径掺入的。通过利用氘标记的前体物的NMR的研究，同样可以获取重要的信息。与氢不同，氘在NMR中不会产生质子的共振信号。在生物合成反应机制的研究中，氘作为一种特殊的标记物质，在生物合成过程的反应位点上取代单个或多个氢原子。在菌株培养过程中，这些中间产物则转变为终产物分子。终产物分子的质子NMR可以显示在酶促反应中，该原子是否被保留或被取代。.2H标记前体物分子中两个相邻的原子对核磁共振光谱峰及其偶合常74二、中间代谢物的鉴定生物合成反应中某一步反应不能进行的突变株的分离，是用来鉴定合成途径中某些中间产物的一种普遍采用的适宜手段。这些被称为“阻断变株”的突变体，常导致培养基中那些无法参与下一步反应的底物的积累。阻断变株可通过对产生菌进行诱变处理，然后分离出那些不具有产生抗生素能力的菌落而获得。将这些变株一次两个在同一摇瓶内培养，发酵液进行抗菌活性的测定。.二、中间代谢物的鉴定生物合成反应中某一步反应不能进行的突变株75两种不同的突变株进行共培养突变株单独培养时不能产生抗生素，但将两种不同的突变株进行共培养时，则可以产生抗生素，表明这两种突变株的突变发生在生物合成途径中的两个不同的阶段。其中一种变株所不能合成的中间物，可由另一种能积累该中间物的变株所提供，从而使抗生素合成的一系列反应得以进行。.两种不同的突变株进行共培养突变株单独培养时不能产生抗生素，但76所积累的产物可以被分离和鉴定为证实这些产物的确是生物合成途径的中间产物，可以通过原始出发菌株，由这些中间产物转变为终产物的实验以进行评价。例如，我们可以将中间产物加入到产生菌的细胞悬浮物中，几小时后，测定其中抗生素的生成量，再与对照组中合成抗生素的量进行比较。

.所积累的产物可以被分离和鉴定为证实这些产物的确是生物合成途径77三、酶的鉴定通过比较产抗生素株与不产抗生素变株中酶的活力，有时可以获取有关生物合成途径的一些信息。产抗生素株中一种酶活力的存在，与阻断变株中该酶的缺失，即可有力地证明这种酶在该生物合成途径中起着重要的作用。在示踪技术和中间物的分离技术为生物合成次序的确定提供足够信息的基础上，有可能从酶的角度来研究单个合成反应。.三、酶的鉴定通过比较产抗生素株与不产抗生素变株中酶的活力，有78四、遗传学与重组DNA技术在过去几年里，由于有关基因的克隆分析等一系列技术的应用，使次级代谢过程的生物合成和调节机制的研究取得了很大进展。最初的研究发现，生物合成基因通常在染色体上成簇存在，在放线菌中尤其是这样。进一步研究又发现，在通常情况下，这些基因簇还包括调节基因和自身抗性基因。.四、遗传学与重组DNA技术在过去几年里，由于有关基因的克隆分79确定生物合成基因两种不同策略1．将某种抗生素产生菌(通常指放线菌)的其中一个基因文库转入到对该抗生素敏感的菌株中，筛选抗性克隆。从这些抗性克隆中分离出编码自身抗性的基因，然后可以着手分离侧翼的结构基因。2．利用在相类似的生物合成途径中功能相似的基因通常具有的高度的同源性，可将相类似的生物合成途径的基因进行杂交。生物合成基因确定后，将其核苷酸序列与数据库中已知的序列进行比较，可以揭示出基因产物的功能和特性，即其酶促作用和调节机能。而且，所推断的酶的氨基酸序列可能有助于我们了解生物合成反应的机制。.确定生物合成基因两种不同策略1．将某种抗生素产生菌(通常80第二节

生物合成反应与途径合成抗生素的酶促反应与生成初级代谢产物的中间代谢并非有根本的不同。事实上，催化特殊代谢物合成的酶是由普通代谢中的酶进化而来。

.第二节生物合成反应与途径合成抗生素的酶促反应与生成初级代谢81抗生素生物合成的途径可分两大类１．对初级代谢产物的修饰反应。这类反应与初级代谢物的合成与分解反应相类似，例如象氨基酸或核苷酸的代谢反应。这些反应的产物可以是一种抗生素，或者是一种结构较为复杂的抗生素的组成成分。在初级代谢物中，有的分子由两个或两个以上的单位组成，如叶酸或辅酶A等。2．相似代谢物的聚合。通过这些反应，通常是先形成复杂而又关键的中间物，然后经过进一步修饰，生成具有活性的终产物分子。.抗生素生物合成的途径可分两大类１．对初级代谢产物的修饰反应。82叶酸蝶啶焦磷酸酯对氨基苯甲酸谷氨酸对氨基苯甲酰谷氨酸蝶啶焦磷酸酯.叶酸蝶啶焦磷酸酯对氨基苯甲酸谷氨酸对氨基苯甲酰谷氨酸蝶啶焦磷83相似代谢物的聚合(1)来源于聚酮体合成的抗生素。其聚合反应机制与脂肪酸合成反应的机制相类似。(2)肽类抗生素，由氨基酸缩合而成，其过程与聚酮体合成的过程相似。(3)类异戊二烯类抗生素，由多个异戊二烯单位缩合而成。(4)氨基糖苷类抗生素，由多个糖单位聚合而成，类似于多糖的合成过程。.相似代谢物的聚合(1)来源于聚酮体合成的抗生素。其聚合反应机84一、初级代谢与次级代谢的关系次级代谢物的大量生成与细胞的初级代谢相比发生了相当大的变化。这种变化体现在要为次级代谢物的生成提供物质和能量(ATP)以及还原性辅酶。将产抗株(尤其是高产突变株)与不产抗株作比较，二者中与抗生素生物合成并无直接关系的酶的水平也可能存在实质性的不同。.一、初级代谢与次级代谢的关系次级代谢物的大量生成与细胞的初级85二、抗生素“家族”的合成一个微生物株系常常会产生几种代谢物，这些代谢物在其化学结构与生物学活性上相类似，因而共同组成一个抗生素“家族”。家族化合物的生成并不仅仅局限于抗生素类，而是次级代谢的一个普遍特征，这一特征归因于酶对相应底物缺乏特异性。事实上，酶通常只识别底物分子的特异区。结构非常相似的比较大的分子，在与酶促作用位点无空间关系的区域内，存在一些细小的差异。这些大分子物质在相应的反应中，会被酶当作底物而识别。

.二、抗生素“家族”的合成一个微生物株系常常会产生几种代谢物，86抗生素家族的合成是由下列因素决定的1.关键中间物通过上述某种途径而合成。2.这一中间物通过通常的代谢反应修饰，如甲基化作用、羟基化作用等等。3.同一种代谢物可以是能生成两种或两种以上产物的几种反应的底物，这两种或两种以上的产物能被转化，因而形成代谢树(metabolictree)。4.由于底物明显缺乏特异性，同样的代谢物可通过两种不同顺序的反应而合成。由此形成代谢网(metabolicnet)。.抗生素家族的合成是由下列因素决定的1.关键中间物通过上述某种87第三节

初级代谢产物向抗生素或抗生素组成部分的转化

一、与氨基酸代谢有关的生物合成途径二、与核苷酸代谢有关的生物合成途径三、与辅酶代谢有关的生物合成途径.第三节初级代谢产物向抗生素或抗生素组成部分的转化一、与88一、与氨基酸代谢有关的生物合成途径一些抗生素，或一些大分子抗生素的组成部分，来源于氨基酸合成代谢或分解代谢的中间产物。

.一、与氨基酸代谢有关的生物合成途径一些抗生素，或一些大分子抗89

氯霉素的生物合成对氨基苯丙酮酸转氨基氧化还原羟基化由分离阻断变株全部中间产物的方法酶已被鉴定.氯霉素的生物合成对氨基苯丙酮酸转氨基氧化还原羟基化由90安莎霉素和丝裂霉素C的生物合成中关键的中间物的合成途径这种产物的一个与众不同的特征，是有一个氨基出现在苯甲酸羧基的间位上(在初级代谢中只有对位或邻位氨基苯甲酸)。312123-H2O-H2O重排关键的中间物.安莎霉素和丝裂霉素C的生物合成中关键的中间物的合成途径这种产91林可霉素中脯氨酰部分形成的过程酪氨酸羟基化

环化氧化,环化酰胺化

氨基酸分解代谢的例子.林可霉素中脯氨酰部分形成的过程酪氨酸羟基化环化氧化,环92氨基酸的β位羟基化次级代谢的一个典型反应是氨基酸的β位羟基化。对氨基苯丙氨酸的β位羟基化是氯霉素生物合成第一阶段反应中的一个反应。β－羟化氨基酸作为几种抗生素分子的组成成分而存在；而在糖肽类抗生素及诺卡菌素中的对羟基苯甘氨酸，则是由酪氨酸经过β位羟基化所引发的一系列反应生成的。.氨基酸的β位羟基化次级代谢的一个典型反应是氨基酸的β位羟基化93克拉维酸的生物合成途径

精氨酸环化β位羟基化环化.克拉维酸的生物合成途径精氨酸环化β位羟基化环化.94二、与核苷酸代谢有关的生物合成途径具有核苷类结构的抗生素是经过与核苷酸合成有关的途径，或通过常见核苷的修饰作用而生成的。

.二、与核苷酸代谢有关的生物合成途径具有核苷类结构的抗生素是经95核苷酸合成的途径1.从头合成。2.通过一种称为“补救途径”的方式合成。这种补救途径包括外源嘌呤或嘧啶碱基的核糖基化作用。有几种抗生素是从修饰常见的核苷或核苷酸而生成的。.核苷酸合成的途径1.从头合成。.96阿糖腺苷的合成

氧化还原烯醇化酮基阿糖腺苷是通过2’－羟基腺苷的差向异构比作用而合成.阿糖腺苷的合成氧化还原烯醇化酮基阿糖腺苷是通过2’－羟基97嘌呤霉素的生物合成腺嘌呤核苷3’—氨基—3’—脱氧腺苷氨基化酪氨酸酰胺化乙酰化N-甲基化O-甲基化去乙酰化嘌呤霉素失活作用.嘌呤霉素的生物合成腺嘌呤核苷3’—氨基—3’—脱氧腺苷氨基98三、与辅酶代谢有关的生物合成途径叶酸中的蝶啶部分及核黄素的合成，是以甲酸的形式，将鸟嘌呤核苷三磷酸第八位碳去掉，以此起始经一系列反应完成的。核苷类抗生素，包括一些杀结核菌素，如丰加霉素与蝶啶生物合成的相似性。核糖是完成蝶啶和抗生素分子两者合成所需要的三个碳原子的供体。.三、与辅酶代谢有关的生物合成途径叶酸中的蝶啶部分及核黄素的合99推断中的丰加霉素的生物合成鸟嘌呤核苷三磷酸187936GTP－甲酰水解酶7—脱氮—腺嘌呤环三磷酸核糖.推断中的丰加霉素的生物合成鸟嘌呤核苷三磷酸187936GTP100第四节

来源于聚酮体合成的抗生素相当数量的抗生素是通过称为聚酮体合成的过程生成的，该过程与初级代谢中脂肪酸的合成密切相关。.第四节来源于聚酮体合成的抗生素相当数量的抗生素是通过称为101脂肪酸的合成脂肪酸的合成是脂肪酸合成酶(FAS)所催化的一个聚合反应过程。在脊椎动物和酵母中，FAS是含有两个亚基(I型FAS)的大的多功能酶；而在细菌和较高等的植物中，则是一个多酶复合体，可被分解为七个以上不同的酶(II型FAS)。.脂肪酸的合成脂肪酸的合成是脂肪酸合成酶(FAS)所催化的一个102脂肪酸聚合反应的几个必要的步骤(1)作为乙酸起始物分子和作为丙二酸延长单位与合成酶如硫脂酶相连接：乙酸与缩合酶亚基(或区域)相连接，而丙二酸与酰基载体蛋白(ACP)相连接。(2)乙酸中的羧基碳缩合成丙二酸的亚甲基碳；与此同时，丙二酸的自由羧基以CO2的形式失去，形成乙酰乙酸，在硫脂酶作用下与ACP相连接。(3)乙酰乙酸中的酮基被还原为羟基。随后脱水产生一个双键，该双键在第二步还原反应中被饱和生成丁酸酯部分。(4)延伸中的链被转移到缩合酶，另一个丙酸单位与ACP连接，反应重复进行，直至达到适合的链长。由硫脂酶将该脂肪酸释放出去。.脂肪酸聚合反应的几个必要的步骤(1)作为乙酸起始物分子和作为103脂肪酸聚合反应的示意图1234.脂肪酸聚合反应的示意图1234.104微生物中脂肪酸的合成模式在微生物中，这一生物合成模式有些不同：在芽胞杆菌属和几种放线菌属中，起始物分子常为小的分支的脂肪酸，并且还形成15～17个碳的分支脂肪酸。另外，还常伴随有一步还原反应被省掉，形成线性不饱和脂肪酸。.微生物中脂肪酸的合成模式在微生物中，这一生物合成模式有些不同105聚酮类抗生素合成的聚合反应不同点聚酮类抗生素合成的聚合反应过程还由两种类型的合成酶所催化：多功能酶I型聚酮亚甲基合酶(PKSI)和多酶复合物II型聚酮亚甲基合酶(PKSII)。与FASs不同的是，这两种类型的酶在同一个属的一些菌株中均存在。.聚酮类抗生素合成的聚合反应不同点聚酮类抗生素合成的聚合反应过106一、芳香族聚酮类抗生素许多由放线菌或丝状真菌产生的抗生素都有一个多元芳香环结构，或者来源于多元芳香环中间物。控制合成的基因编码具有II型PKS特征的蛋白。这些蛋白在结构和功能上与II型FAS相似，但是缺少上述脂肪酸合成第3点中使酮基还原的亚基。聚合反应的产物是一个聚酮亚甲基链(聚酮体)，即酮基与亚甲基相互更换的一个线性分子。这个链具有很高的反应活性，并趋向于通过酮基与亚甲基的醛醇缩合作用而折叠成环。根据链的长度与参与其中酶的特性由立体空间和能量所决定，导致形成许多由芳香环组成的不同的结构。.一、芳香族聚酮类抗生素许多由放线菌或丝状真菌产生的抗生素都有107

四环素的生物合成丙二酰胺醛醇缩合氧化氧化氨基化甲基化羟基化还原,烯醇化.四环素的生物合成丙二酰胺醛醇缩合氧化氧化氨基化甲基化羟基108

灰黄霉素的生物合成氯化甲基化还原环化.灰黄霉素的生物合成氯化甲基化还原环化.109二、聚酮体抗生素的生物合成有几种类型的抗生素的生物合成涉及小分子羧酸的聚合，其机制与脂肪酸合成有关，然而在许多重要的方面都与后者相异。.二、聚酮体抗生素的生物合成有几种类型的抗生素的生物合成涉及小110与脂肪酸合成的差异1.起始物通常是丙酸，但有时也包含其他脂肪酸或芳香族酸类。2.较常见的延长分子是甲基丙二酸。若甲基丙二酸是延长单位，结果所得到的链状分子中就带有甲基取代基。若是乙基丙二酸，则得到的是乙基取代基。因为延长中的链的缩合总是发生在羰基的邻位碳上。3.省略了脂肪酸合成的第三点的还原步骤。.与脂肪酸合成的差异1.起始物通常是丙酸，但有时也包含其他脂111与芳香族聚酮类的差异链状分子中可能存在酮基或羟基功能团或双键结构。因为烷基取代基的存在，链状分子中不含有这一系列由相邻酮基激活的亚甲基，因而不能经由简单的脱水反应而形成芳香环。最终的结构只能是链状分子或由酰胺键连接的大型环状分子(大环内酰胺)，或是酯键连接的大型环状分子(大环内酯)。.与芳香族聚酮类的差异链状分子中可能存在酮基或羟基功能团或双键112聚酮体抗生素生物合成基因生物合成基因都包含一个或多个被称为合酶单位(SU)的区域。每一个SU组成了一个具有类FAS活性的区域，这种活性对完成一个完整的延长过程是必需的，这包括选择延长单位，缩合过程、并且在恰当的时候对全部或部分醛基进行还原。在一个循环完成后，新生成的聚酮体被转移到邻近的合酶单位上，在此处加上另外一个延长单位并继续进行。因此，SU排列的顺序决定功能基因最终产物的顺序，SU的数目决定链的长度。.聚酮体抗生素生物合成基因生物合成基因都包含一个或多个被称为合113组成红霉素骨架的分子链顺序的构建6-去氧红霉内酯BI型聚酮亚甲基合酶甲基丙二酸丙酸缩合，还原缩合缩合缩合，还原缩合，还原缩合，还原.组成红霉素骨架的分子链顺序的构建6-去氧红霉内酯BI型聚酮亚114链状分子的基本结构及其酶促折叠情况决定了最终的抗生素属于哪一类型14和16大环内酯抗生素具有26至28原子的多聚烯烃安莎霉素类(大环内酰胺)每一类型中都有大量的抗生素是因不同产生菌的其他生物合成基因的特异性而产生的。.链状分子的基本结构及其酶促折叠情况决定了最终的抗生素属于哪一115红霉素A过程的生物合成反应的次序6-羟基化5-去氧糖胺3-红霉糖甲基化12-羟基化甲基化.红霉素A过程的生物合成反应的次序6-羟基化5-去氧糖胺3-红116利福霉素B生物合成主要步骤酰胺化,羟基化羟基化甲基化,乙酰化,插氧乙酸化在利福霉素B的结构中，碳链被插入其中的氧原子所打断。.利福霉素B生物合成主要步骤酰胺化,羟基化羟基化甲基化,乙117第五节

来源于氨基酸聚合反应的抗生素

.第五节来源于氨基酸聚合反应的抗生素.118一、硫代模板机制有很大