微生物培养和分离上课用

微生物的利用微生物包括哪五类：病毒细菌放线菌真菌原生动物

原核生物特点：结构简单,形体微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.细菌的外形与大小

细菌细胞微小而透明，通常用适当染料染色后显微镜观察

球菌杆菌弧菌细菌的构造*细胞壁细胞壁有哪些功能？

①固定细胞外形；②保护细胞免受外力的损伤；③阻拦大分子物质进人细胞④使细胞具有致病性及对噬菌体的敏感性。肽聚糖菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。细菌的菌落特征因种而异接种扩大培养培养平板划线法准备菌种观察并记录结果配制培养基准备器皿及用品灭菌

倒平板微生物培养操作流程稀释涂布法成分作用主要来源碳源主要作能源物质无机碳(CO2)或有机碳(糖类)氮源含N类化合物NH3，铵，硝酸盐，牛肉膏，蛋白胨无机盐调节渗透压等水生长因子调节促生长维生素，AA，碱基等培养基成分按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。培养基类型液体培养基固体培养基凝固剂琼脂扩大培养，工业生产分离纯化，鉴定菌种，计数，保藏选择培养基鉴定培养基天然培养基合成培养基选择培养基加入青霉素的培养基:

分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:

分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:

分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:

分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基:

分离导入了目的基因的受体细胞天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;

根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。

优点：标准化生产，组分和含量相对固定;成本低

缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。合成培养基:天然培养基：液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长固体培养基：菌落，菌苔半固体培养基：无动力有动力(弥散)(是否运动)

如下图所示某微生物培养配方，请回答（1）依物理性质，该培养基属于_______培养基。（2）依用途划分，属于_______培养基。（3）依培养基原料，所培养的微生物的代谢类型是_______，培养的微生物可能是_______（4）该培养基中的碳源是_______。（5）如要鉴别自来水中的大肠杆菌是否超标，至少要加入_______和_______，除去_______无菌技术

无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。无论是随后将要学到的倒平板、平板划线操作，还是平板稀释涂布法，其操作中的每一步都需要做到“无菌”，即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。

（1）消毒定义：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。注：消毒不能杀死芽孢。消毒与灭菌的概念及两者的区别

1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法(间歇消毒法)：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min（牛奶）3、化学药剂消毒法:用70%酒精进行皮肤消毒;氯气消毒水源4、紫外线消毒（空气）常用消毒的方法：

灭菌的定义：以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌之过程。灭菌的方法：1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.常用灭菌的方法：1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸汽灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.

最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。

有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。

培养皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。

计算-称量-混合-溶化-调PH-灭菌-倒平板灭菌：加上封口膜，用牛皮纸包好放在高压蒸汽灭菌锅中灭菌，1Kg压力灭菌15Min步骤一：制备培养基(液)倒平板紫外灯，过滤风，酒精灯，酒精棉球在火焰旁右手3指拿锥形瓶，2指拿封口膜使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置倒平板过程总结1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？问题讨论

答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？

答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？

答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。纯化大肠杆菌接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法

平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.

在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.微生物的接种技术平板划线工具：接种环在接种前要灭菌灼烧接种环冷却

划线（第一区域）蘸取菌液灼烧接种环冷却

划线（第二区域）灼烧接种环冷却

划线（第三区域）灼烧接种环冷却

划线（第四区域）灼烧接种环冷却

划线（第五区域）灼烧接种环平板倒置放置培养平板划线的操作

不能使用脱脂棉，否则容易吸水，造成污染。

一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者

为什么在造作的第一步以及每一次划线前都要灼烧接种环？在划线结束时，任然需要灼烧接种环？2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？

划线末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。以避免接种环温度太高，杀死菌种稀释涂布法问题讨论

涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？

应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。微生物的恒温培养微生物的恒温培养菌种的保存1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。

2、长期保存：甘油冷冻管藏法1）血球计数板直接计数2）比浊法计数3）稀释涂布平板法计数微生物数量统计

血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网。

1）血球计数板直接计数血球计数板25×1616×25利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。

每一个大方格边长为lmm，则每一大方格的面积为lmm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数(即0.1mm3中的总菌数)为A/5×25×B。因为:1ml=lcm3=1000mm3，故:lml菌液中的总菌数为：

A/5×25×l0×l000×B

如果待测样品数量稀少，可以直接计数。如果样品密度很大，为了使计数准确，常常将待测样品稀释成不同浓度的菌液，再进行计数。

美蓝染液用于鉴别酵母菌的活细胞和死细胞。活细胞不着色，死细胞为蓝色。2）比浊法计数

实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数，做出校正曲线。实验中偶尔会出现菌液的OD值出现负值，原因是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间后，与培养基反应，发生变色反应。另外，需要注意的是，测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态。3