酶联免疫吸附试验（胡荣）

酶联免疫吸附试验（ELISA）主讲：胡荣一、基本原理将已知抗体（抗原）吸附在固相载体表面以后，抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤的方法使固相上形成的抗原抗体复合物与其它物质分离，最后加入底物，根据酶对底物催化的显色反应程度，对标本中的抗原（抗体）进行定性或定量。

基本过程：包被→加样→洗涤→显色ELISA

间接法双抗原夹心法竞争法

捕获法检测Ag方法检测Ab方法

双抗体夹心法

双位点一步法

竞争法二、技术类型ELISA学习总体思路（三步曲）名称中找技术要点作原理模式图理清思路“提问”提出注意点ELISA1、双抗体夹心法（最常用）1）、包被抗体、洗涤；2）、加待测标本，温育、洗涤；3）、加酶标抗体，温育、洗涤；4）、加底物显色。（载体-Ab-Ag-Ab*E）注意点：RF可引起假阳性结果。（一）检测抗原的技术类型ELISA

E固相抗体标本（含抗原）酶标抗体EE底物双抗体夹心法检测抗原1、已知抗体包3、加酶标抗体4、加酶作用的底物2、加待检物4、加酶作用的底物1、已知抗体包2、加待检物无抗3、加酶标抗体EYYYYEYEYYYYEYYYYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYY双抗体夹心法检测抗原+-洗涤洗涤洗涤洗涤2、双位点一步法

将固相抗体和酶标抗体换为针对抗原分子上两个不同表位的两种McAb。测定时将含待测抗原标本与酶标抗体同时加入进行结合反应，两种抗体互不干扰，经过一次温育和洗涤后，加入底物进行显色测定。

（载体-Ab-Ag-Ab'*E）

注意点：避免“钩状效应”导致假阴性。

ELISA双位点一步法检测抗原

EEE底物固相抗体标本（含抗原）酶标抗体3、竞争法

1）、包被抗体（目标）；

2）、加待测抗原（甲）和酶标抗原

（乙），温育、洗涤；

3）、加底物显色。

（载体-Ab-Ag/Ag*E）注意点：底物显色深浅与待检标本中抗原含量

成反比。ELISA阳性阴性YYY2、加待测物抗原及酶标抗原与抗体竞争结合3、加酶作用的底物不显色或显色弱3、加酶作用的底物显色1、已知抗体包被于载体表面1、已知抗体包被于载体表面2、加待测物抗原及酶标抗原竞争与抗体结合竞争法检测抗原YYYEYYYEYYYYYYEEEYYYEEE

1、间接法（最常用）

1）、包被抗原；

2）、加适当稀释的待测标本，温育、洗涤；

3）、加酶标二抗，温育、洗涤；

4）、加底物显色。

（载体-Ag-Ab1-Ab2*E）注意点：可用一种酶标二抗检测各种与抗原相应的抗体，只要求一抗是同类即可。（二）检测抗体的技术类型ELISA

间接法检测抗体固相抗原标本（含抗体）酶标二抗底物EEE2、双抗原夹心法

1）、包被抗原；

2）、加待测标本，温育、洗涤；3）、加酶标抗原，温育、洗涤；4）、加底物显色。

（载体-Ag-Ab-Ag*E）注意点：若采用一步法因机体产生抗体IgG的效价有限，一般不会出现钩状效应。ELISA酶标抗原固相抗原待测抗体底物双抗原夹心法检测抗体模式图3、竞争法A：竞争法检测HBcAb

1）、包被HBcAg（目标）；

2）、加待测标本（甲）和酶标抗体

（乙），温育、洗涤；

3）、加底物显色。

（载体-Ag-Ab/Ab*E）ELISA竞争点竞争法检测HBcAb示意图固相抗原标本（含抗体）底物酶标抗体EEEEE固相抗原标本（含抗体）底物酶标抗体EEEEEB：竞争法检测HBeAb

1）、包被HBeAb（甲）；

2）、加待测标本（乙）和HBeAg（目标），

温育、洗涤；

3）、加酶标HBeAb（丙），温育、洗涤；4）、加底物显色。

（载体-Ab-Ag-Ab/Ab*E）ELISA固相抗体标本（含抗体）抗原酶标抗体底物EEE竞争法检测HBeAb竞争点

注意点：待测标本中HBeAb量越高，则与HBeAg结合越多，固相HBeAb结合的HBeAg越少，加入酶标抗体后显色越浅。因此显色深浅与标本中相应抗体含量成反比。

ELISA4、捕获法

1）、包被抗人IgM抗体；

2）、加入待测稀释血清，捕获血清中所有的

IgM，温育、洗涤；

3）、加入特异性Ag，温育、洗涤；

4）、加入针对特异性Ag的酶标抗体，温育、洗涤；

5）、显色，定性、定量特异性IgM。（载体-抗人IgM-IgM-Ag（特异性）-Ab*E）

ELISAEYEYEYEYEYYYYYYY1、固相化抗人IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人IgM2、加待测物，特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，与特异性抗体结合4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色洗涤洗涤洗涤洗涤捕获法检测抗体IgM+-注意点：1、急性感染的早期诊断；2、最常用的IgM抗体检测方法；3、RF（IgM类）可致假阳性结果；4、适当稀释以减少标本中非特异性IgM的干扰。ELISAELISA

（一）应用1、病原体及其抗体检测广泛用于传染性疾病（病毒、细菌、寄生虫感染）的检测。2、蛋白质测定AFP、CEA等。3、非肽类激素测定T3、T4、TSH等。4、药物和毒品测定地高辛等。

三、ELISA的应用和注意事项ELISA（二）注意事项1、加样

定性：滴加液体时每滴液体体积基本相同。

定量：加样量力求准确：加在孔底，避免气泡和溅出。2、温育

时间：按说明书要求。

温育容器：水浴箱（内置湿盒）、恒温箱。

注意点：勿叠放，避免“边缘效应”。ELISA3、洗涤

目的：洗掉非特异性吸附。方法：手工洗板；洗板机洗板（多洗一次）。4、显色时间：按试剂盒要求。5、比色波长选择：根据底物不同选择不同的波长。（TMB：450nm）方法：单波长比色、双波长比色（最常用）。ELISA单波长比色：测定显色液在敏