生物素-过氧化物酶讲课教案

生物素-过氧化物酶第一节生物素－亲和素免疫细胞化学技术一、基本原理（一）生物素（Biotin）与亲和素/卵白素/抗生物素（Avidin/anti-Biotin）之间有很强的亲和力；（二）生物素和亲和素具有与其它示踪物质如荧光素和过氧化物酶等相结合的能力。二、几种经典的抗生物素－生物素染色法（一）ABC（AvidinBiotin-peroxidaseComplex

）技术（二）LAB（LabelledAvidin-Biotin）技术（三）LSAB（labeledstreptavidinbiotinmethod）：

S-P（streptavidin－peroxidase）技术

SABC（streptavidin-biotincomplex）技术（四）BRAB（BridgedAvidin-Biotin

）技术（五）CSA（Catalyzedsignalamplification）法

（六）Envision技术（一）亲和素-生物素-过氧化物酶（AvidinBiotin-peroxidaseComplex，ABC）技术

1．基本原理2、操作步骤（1）石蜡切片常规脱蜡至水，冰冻切片经冷丙酮固定，用PBS洗；（2）用3%H2O2甲醇液室温作用20min后，充分水洗；（3）PBS洗，加牛血清白蛋白或二抗动物种属正常血清15min；（4）加第一抗体（即用型或浓缩型）4℃过夜或37℃1h；（5）PBS洗，加生物素化第二抗体37℃30min；（6）PBS洗，加ABC复合物（1∶100,使用前30min将等量的亲和素和酶标生物素混合，稀释配制成ABC复合物),37℃20min；（7）PBS洗，经DAB/H2O2显色；（8）常规脱水，透明，中性树胶封固。3、ABC法的优点（1）敏感性高:结合力强,分子量小;（2）特异性强，背景染色淡；（3）方法简便，节约时间；（4）由于生物素与抗生物素具有与多种标记物结合的能力，可用于双重或多重免疫染色。（二）标记生物素-抗生物素技术（LabelledAvidin-BiotinTechnique,LAB技术）

1、基本原理以生物素标记抗体作第一抗体，酶标记抗生物素作为第二抗体，同S-P技术

LAB法示意图2、操作步骤（1）①-④步骤与ABC法相同；（5）PBS洗后加生物素标记第一抗体37℃30min；（6）PBS洗后加酶标亲和素（如HRP-Avidin）37℃30min：（7）以下步骤同ABC法。

（三）LSAB（labeledstreptavidinbiotin）技术：S-P（streptavidin－peroxidase）技术

SABC（streptavidin-biotincomplex）技术

1、基本原理2、操作步骤（1）常规切片脱蜡至水；（2）必要时抗原修复：如高温高压修复；（3）3%H2Ｏ2甲醇液阻断内源性过氧化物酶15min；（4）水洗，PBS洗，10%牛血清白蛋白20min；（5）加一抗4℃过夜或37℃孵育1h；（6）PBS洗，滴加生物素化的二抗37℃30min；（7）PBS洗，滴加HRP标记链霉亲和素（S-P复合物）或链霉亲和素－生物素（SABC），37℃孵育20min；（8）DAB/H2Ｏ2显色，常规脱水、透明、中性树胶封固。（四）BRAB（BridgedAvidin-Biotin

）技术1、原理以生物素标记抗体作第一抗体，抗生物素作为第二抗体，桥接酶标生物素。

2、操作步骤（1）①-③步骤与ABC法操作相同；（2）加一抗4℃过夜或37℃1h；（3）PBS洗后加生物素标记的第二抗体37℃30min；（4）PBS洗后加亲和素37℃孵育30min；（5）PBS洗后加HRP酶标记生物素37℃30min；（6）PBS洗后用DAB/H2Ｏ2显色；（7）常规脱水、透明、中性树胶封固。（五）CSA（Catalyzedsignalamplification）法

1、原理根据两次生物素-Streptavidin-HRP反应，聚合示踪物质（HRP催化底物生物素化酪胺成不溶性生物素化酪胺，沉淀在局部），使原始信号得到几何级放大，敏感性更高，尤其适合原始信号较弱的信号检测，但操作较复杂。第一步第二步第三步第四步第五步2、操作步骤（1）常规脱蜡至水，必要时用抗原修复处理；（2）3%H2Ｏ2甲醇液15min；（3）正常封闭血清，室温20min，甩干；（4）滴加特异性一抗4℃过夜或37℃孵育1h；（5）PBS洗后，滴加生物素化二抗37℃30min；（6）PBS洗（一定要充分），滴加Streptavidin-HRP，37℃孵育20min；（7）PBS洗，滴加生物素化酪胺基团分子，37℃孵育20min；（8）PBS洗（一定要充分），滴加Streptavidin-HRP，37℃孵育20min；（9）PBS洗后，DAB/H2Ｏ2显色；（10）苏木素衬染细胞核，脱水、透明、封片，显微镜观察。（六）Envision技术１、原理用高分子的葡聚糖作为载体，将大量的二抗分子和HRP结合成多聚体，具有很强的信号放大功能，对膜和浆表达的抗体特别敏感。敏感，简便。2、操作步骤（1）组织切片常规脱蜡至水，PBS洗；（2）用3%H2Ｏ2甲醇液阻断15min，水洗，PBS洗；（3）抗原修复处理，PBS洗；（4）正常山羊血清封闭15min；（5）滴加第一抗体，37℃孵育1h；（6）PBS洗（一定要充分），滴加HRP-聚合物-抗体复合物37℃，60min；（7）PBS洗（一定要充分），DAB显色；（8）苏木素衬染，脱水、透明、封固。附免疫多染技术原理用不同来源的抗体和不同的染色同时检测同一标本中的多种抗原标记物。第二节葡萄球菌A蛋白（SPA）的应用葡萄球菌A蛋白（staphylococalproteinA，SPA）一、特性：

1、多肽单链蛋白，对热和变性剂十分稳定；2、能与某些哺乳动物IgG的Fc段特异性结合；3、可以被各种标记物所结合，形成SPA标记物。二、应用

SPA主要在免疫组织化学中替代连接抗体（桥抗体），可不受动物种属限制。三、常见问题及处理

主要是无信号、信号弱、杂信号等三种。当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。一定设对照，主要是阴性对照和阳性对照。（一）无信号染色结果阳性对照/标本均无染色，出现无信号染色现象有两种原因：

1、真阴性结果：组织或细胞不表达抗原，无法检测到相关信号；或表达抗原太低，所使用检测系统不足以达到检测所需要的灵敏度。

2、假阴性结果：原因有两种：

（1）染色前错误：切片时选错蜡块和选错切片，这种情况可用H&E染色验证。

（2）染色中错误：

①确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等；

②确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间；

③对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的；④检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价；⑤检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液是否合适；⑥确定标本的处理及储存条件；⑦检查色原/底物溶液，底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效；

⑧检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠；⑨检查复染剂、脱水、透明和封片剂是否和所使用的色原匹配如：HRP用中性树胶，荧光素用水溶性封片剂，AEC等不能用二甲苯有机溶剂透明。

（二）信号弱如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了上述因素外，还有：

1.标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高；2.抗原修复方式不当；3.抗原位于细胞内，未使用穿孔剂如0.05%TritonX-100或EDTA，有助于抗体渗透入细胞内，也可降解内源性Fc受体；4.抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确；5.切片上遗留了过多的冲洗液，；6.孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。三、杂信号由于切片、内源性IgG、Fc受体、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素的存在等原因，同时组织在处理过程中如高温修复也会使更多的内源性生物素暴露，造成染色组织上会出现非抗原部位的非特异性染色、边缘效应等杂信号。原因分析如下：（一）全片着色

1.是否有效地去除了内源性酶和生物素；2.封闭液的使用：是否选择使用了正确的封闭血清；3.所选择的抗体是否符合试验要求，主要是抗体纯度；4.一抗的使用浓度是否过高；5.清洗是否充分，DBA的使用是否正确，边缘效应；6.检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应；7.组织抗原弥散等。（二）部分着色1.灶片装着色：切片捞片时应一步到位，避免产生气泡，组织局部鼓起。

2.阴阳着色：测试片未放平，滴加试剂偏向一侧。

（三）着色部位改变

1.间质着色：原因很多：抗体与组织中的蛋白质因疏水基团相互作用形成非特异性的连接造成，血清封闭可避免此中影响因素；靶抗原外溢到组织间隙；抗体不纯或被污染；2.细胞浆着色：内源性物质残留如酶、生物素或产生非特异性吸附的蛋白；3.细胞核着色：不适当的组织处理可以出现细胞核着色，如组织在二甲苯、缓冲液中浸泡时间过长、组织变干、修复液pH值和修复时间不当、组织没有浸没在修复液中等。四、石蜡切片免疫组化染色步骤

1、载玻片的处理：

抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用防脱片试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：

1.1APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。1.2HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。1.3Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。2、常用酶消化：2.1胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。2.2胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），CollagenIV（IV型胶原）等。2.3皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10mg/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。

3、抗原热修复：

可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。其pH值在6.00.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整，常用方法如下：3.1石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：

切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。3.2石蜡切片高压抗原修复操作方法：

切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。

3.3石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：

切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。五、冰冻切片免疫组化染色步骤冰冻切片4~8m，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。下接免疫组化染色操作步骤。六、细胞贴片免疫组化染色步骤

PBS洗去贴片残余物，入1:1的4℃丙酮:无水乙醇混合固定液固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化