第六章DNA序列多态性分析

第六章DNA序列多态性分析

（AnalisisofSequencePolymorphism）一、掌握DNA序列多态性概念；了解DNA序列测定及多态性分析基本技术。熟悉法医学应用价值评价。二、了解等位基因特异性探针杂交技术基本原理、技术及方法、常用遗传标记系统。三、了解扩增片段限制性长度多态性（PCR-RFLP）分析的基本原理、技术、方法及常用遗传标记系统、法医学应用。四、了解MVR-PCR序列多态性分析技术的基本原理技术，常用遗传标记系统、基本分型方法及法医学应用。五、了解序列多态性的其他分析技术。教学要求核染色体STR分型局限性

作案现场只发现有头发或长期暴露于外界环境的骨骼，这些检材中核DNA含量很少或降解，无法进行STR分型。DNA序列多态性

（DNAsequencepolymorphism）概念：基因组DNA核苷酸序列在不同个体间最本质的遗传差异，在特定的基因座上不同个体的等位基因之间由碱基序列差异构成的DNA多态性叫做序列多态性。同一个体的不同组织细胞中的基因组DNA序列是相同的，这是根据DNA序列认定同一性的前提条件。主要包括线粒体序列多态性和核基因组单核苷酸多态性。人类基因组计划完成，序列多态性的研究将成为新兴热点。序列多态性的检测方法经典测序技术（双脱氧核苷酸链终止法和化学裂解法)等位基因（序列特异性）寡核苷酸探针杂交（ASO-PCR）技术扩增限制性片段多态性技术(

PCR-RFLP)序列多态性分析技术（MVR-PCR

）DNA芯片(DNAChip)基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）变性高效液相色谱法(TmHPLC)焦磷酸测序技术微测序方法实时荧光定量PCR技术DNA测序的两种经典方法：双脱氧核苷酸链终止法（thechainterminationmethod）单链DNA分子的序列由与之互补的多核苷酸链的合成来判定，互补链在某一特定的核苷酸位置终止。化学降解法（chemicaldegradationmethod）双链DNA分子被化学物质修饰后，在特定核苷酸位置被切开，从而确定DNA分子的序列。

法医学上常用的序列多态性分析技术DNA序列分析——mtDNA分型PCR-ASO技术——HLA-DQAl

基因座PCR-RFLP技术——ABO基因、mtDNA第一节双脱氧核苷酸链终止法测序Sanger测序及其改进方法Sanger双脱氧末端终止法（32P标记、放射自显影）PCR循环测序ＤＮＡ自动测序技术（标记引物或ddNTP）Sanger双脱氧链终止DNA测序法：利用DNA聚合酶和双脱氧链终止测定DNA核苷酸顺序的方法，是由英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家F.Sanger等人于1977年发明的。1980年诺贝尔奖金获得者F.SangerSanger双脱氧链终止DNA测序法的基本原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的DNA分子。

利用DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP参入到寡核苷酸链的3’-末端。因为ddNTP3’不是-OH，不能与下一个核苷酸聚合延伸，从而终止DNA链的增长。技术路线与要求制备单链模板↓将单链模板与一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸分别加入少量4种双脱氧核苷酸↓将4种反应产物分别在4条泳道电泳

↓根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列

在每一反应试管中，都加入一种互不相同的ddNTP和全部4种dNTP，其中ddNTP带有32P同位素标记。反应混合物样品加在聚丙烯酰胺凝胶中，按片段大小进行电泳分离。谱带的判读是从胶的底部开始，所得的核苷酸碱基顺序，与模板链为互补链。1.用M13噬菌体做载体获得单链DNA模板，克隆并扩增待测DNA片段，使其变性。2.选择一条与DNA单链互补的短链引物，引物先同单链模板复性3.引物的延长和合成阻断4个试管分别加入：模板、DNA聚合酶、dNTP-标记底物（32P等）终止剂不同

ddATP

ddGTP

ddCTP

ddTTP4个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链4.电泳：ACGT次序4道凝胶高压电泳5.放射自显影得到直读图谱。Sanger双脱氧末端终止法测序过程链终止法对DNA多聚酶的要求酶活性高保证不会反应提前终止无5’→3’外切酶活性保证不切除新合成链的5’端，改变链长度，给读序造成误差有3’→5’外切酶活性校正引物3端错配碱基保证不切除新合成链的3’端，改变链长度，给读序造成误差测序的DNA多聚酶目前普遍采用的测序酶为Sequenase,来自T7噬菌体将DNA克隆到质粒载体这种方法是获得测序模板DNA最常用的方法。获得的DNA通过热变性或者碱变性转变为单链DNA进行测序。优点：可双向测序。缺点：样品可能有少量细菌的DNA或者RNA污染，会干扰测序。链终止反应要求单链作为模板如何得到单链DNA？将DNA克隆到M13噬菌体载体M13噬菌体载体是专为得到单链DNA测序模板而设计的。M13噬菌体本来含有单链DNA基因组，感染大肠杆菌的M13可转变为双链复制型。M13噬菌体载体是双链的，相当于M13噬菌体的复制型。用含有待测序片段的M13噬菌体载体感染大肠杆菌，大肠杆菌分泌的噬菌体就含有单链DNA基因组。缺点：只能用于短片段DNA，大于3kb的片段在克隆过程中会发生缺失和重排。PCR产生单链DNA引物决定模板链的测序起点SequencingofDNAbytheSangermethod(Layer1)Radioactivelylabeledwith32P含靶DNA片段的重组体SequencingofDNAbytheSangermethod(Layer2)Radioactivelylabeledwith32P55℃水浴中保温30minSequencingofDNAbytheSangermethod(Layer3)高压凝胶电泳与放射自显影高压凝胶电泳与放射自显影人工判读图谱操作繁琐（准备模板、4管反应、4道电泳）效率低（人工判读等）时间毒性（放射性标记物）Sanger测序方法的局限性（二）循环测序（cyclesequencing）1．基本原理：先利用PCR扩增靶序列片段，制备测序模板，然后再利用PCR直接测定序列；采用了PCR热循环高效合成DNA的特性并结合双脱氧核苷酸终止法，使引物链终止的延伸产物数量在热循环过程中得到增加，因此称为循环测序。每个测序循环包括：①PCR扩增制备的模板DNA变性成单链形式；②标记引物与其中的一条链上的互补序列退火；③退火后的引物在耐热DNA聚合酶催化下发生链延伸终止反应。上述循环步骤重复20~40次，使链终止产物以线性方式获得扩增。（二）PCR循环测序循环测序法PCR扩增靶序列模板PCR循环反应Radioactivelylabeledwith32P含靶DNA片段的重组体55℃水浴中保温30min循环测序反应与普通PCR反应比较循环测序反应普通PCR反应引物一条两条底物dNTP＆ddNTPdNTP

产物增长线形方式指数形式循环测序的优点简单、易操作；所需模板DNA量少PCR产物3～10ng；减少模板的二级结构；适合于双链及单链DNA测序；

PCR产物可直接测序，效果好。4种不同荧光染料标记ddNTP

；

PCR循环扩增在同1管中；PCR仪上进行热循环反应；单道凝胶电泳或毛细管电泳；激光检测装置；计算机自动分析结果。（三）荧光标记循环测序全自动分析1.荧光标记循环测序步骤

1）模板制备：PCR扩增2）反应体系：含适量的模板、引物、dNTP、荧光标记的ddNTP、DNA聚合酶、缓冲体系。3）PCR热循环参数：94℃-1min；40～60℃-30s；72℃延伸30s，共20～40个循环。（三）荧光标记循环测序全自动分析4）纯化扩增产物，在DNA测序仪上电泳（变性聚丙烯酰胺凝胶或毛细管电泳），经激光发射装置激发荧光标记的ddNTP，使后者产生不同的激发光；5）收集信号不同的ddNTP呈现不同颜色；6）电泳结束后，由相应的序列分析软件分析数据，得到核酸序列。1.荧光标记循环测序步骤荧光标记ddNTP4种不同荧光染料标记置于1管中PCR扩增靶序列模板PCR循环激光检测装置（三）荧光标记循环测序全自动分析荧光检测自动分析序列4种不同荧光染料标记ddNTP反应同1管中；

PCR仪上进行热循环反应；激光检测装置：单道凝胶电泳或毛细管电泳；计算机自动分析结果。快速、简便、自动化分型等优点2.荧光标记循环测序全自动分析优点AB3730XL全自动基因分析仪

双光束双侧激发激光，光栅分光装置和后置超薄CCD检测成像系统；内置一体化自动进样器及样品孔打孔装置；内置样品板条形码自动识别；含96根毛细管可同时在2.5小时内测定96个样品；自动碱基识别与质量评分判定；新型POP-7液体分离胶；电泳温度范围18-70℃；使用50cm毛细管,可使读序长度达1100bp，精确度800bp以上。3.三种方法比较链终止法循环测序自动测序反应管4个4个1个反应条件55℃30minPCR循环PCR循环标记物同位素（32P）同位素（32P）荧光染料标记对象ddNTPPrimerddNTP电泳方式4道凝胶4道凝胶1道凝胶/毛细管图谱显示X光胶片X光胶片激光荧光检测序列分析人工判读人工判读计算机自动分析第二节等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术

（allelespecificoligonucleotide,ASO）根据碱基互补的原则,制备识别特定寡核苷酸序列的单链DNA探针,并标记示踪物,在高强度条件下与变性DNA样品杂交,检测示踪物,阳性者为检出相应的等位基因。

一、基本原理：

1.

相关概念：

A：杂交：两条异源寡核苷酸单链按照碱基互补的原则复性为双链的过程。

B：探针：标记有示踪物，能够识别靶核苷酸序列并与之退火杂交的具有以知序列的寡核苷酸单链。

2.探针的条件:A:长度为20bp左右。

B：具备高度特异性。

C：容易标记示踪物。

D：在杂交过程中本身性质稳定。核酸分子杂交反应

3.对示踪物的要求

A:高灵敏度。

B:不影响探针的特异性。

C:不影响探针的杂交特性。

D：不改变本身的特性。

E：检测方法特异。

F：安全可靠无公害。

G：检测方法简单，重复性好。PCR-ASO探针杂交：A：针对序列多态等位基因序列设计特异性探针;B：

PCR扩增各等位基因，变性;C：

ASO探针与PCR产物杂交反应：高强度杂交-温度高，离子强度低。特异不利于复性。低强度杂交-温度低，离子强度高。利于复性不特异。D：洗去未结合/结合不牢固的非特异性探针;E：检测标记物是否存在。二、基本过程

杂交分类正向杂交

固定PCR产物；标记探针；反向杂交固定探针；标记PCR产物－－

DNA芯片技术三、常用遗传标记系统

（一）HLA-DQAHLA-DQAl

基因座反向斑点杂交检测是法医学应用最早的PCR技术序列多态性分型技术。

（二）Polymarker系统。

PM系统包括LDLR、GYPA、HBGG、D7S8和GC等5个多态性DNA基因座。这5个基因座彼此独立，没有连锁关系，系统识别率是各基因座的乘积，因此系统具有较高识别能力，在法医学应用中具有重要价值。①分型技术简单，结果判定容易，②无需电泳步骤，避免了片段长度测定的误差，杂交后可以准确判定基因型。③结果重复性好，分析结果可以数字化的形式记录保存，适于大范围人员的排查。④特异性好，灵敏度高，对检材质量要求低。该方法已经具有标准化、商品化的特征。四、法医学应用

第三节扩增片段限制性长度多态性(RFLPbyPCR

)PCR-RFLP分析是将RFLP分析与PCR技术联合应用，先将靶基因相关片段用PCR扩增，然后对扩增产物片段进行酶切，检测片段长度多态性。这种多态性现象称为限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）。1.基本原理

利用两个片段之间的序列差异，而且这种差异刚好构成一个限制性核酸内切酶识别位点，或使原有的限制酶识别位点丢失或识别位点移动了位置，选择合适的限制酶切割PCR产物，从长度不一的DNA酶切片段，可以判断等位基因及基因型。

（1）先用PCR技术扩增含有序列差异的待测DNA片段；（2）根据靶片段序列特点，选用合适的限制酶切割PCR产物；（3）运用凝胶电泳分离酶切割产物，根据片段的数量和片段长度判定等位基因和基因型。2.分型法RFLPA、B、O基因PCR-RFLP分型B基因可以切开，A、O基因不能切开O基因可以切开，A、B基因不能切开3.常用遗传标记系统

ABO基因分型凝胶电泳图PCR-RFLP法判定ABO基因型

M200160AB

OOBOBBAOAAmtDNA的PCR-RFLP分型mtDNA

序列多态性主要是点突变的结果，在HV-I和HV-II区段，具有变异的碱基位置有700～800个，其中大约有2/3的碱基变异涉及到限制酶识别点回文式序列的改变，构成典型的RFLP现象。在mtDNA控制区D环，有88个点突变点，其中只有21个能够采用RFLP分析。4.PCR-RFLP基本流程

1.模板DNA提取；血液、毛发2.引物序列；一对引物3.PCR扩增反应体系及热循环参数；4.酶切消化；扩增产物中直接加入HaeIII2.5U，置37℃孵化30分钟。5.垂直PAGE分离和银染；设置DNA分子量标准作对照。6.基因型分型；酶切（＋）、酶切（－）

PCR-RFLP技术的优势：①分型技术简单，结果判定容易。②电泳后不需测定片段长度，避免了测量误差，可以准确判定基因型。③分型结果稳定，重复性好，分析结果可以数字化的形式记录保存。④特异性好，灵敏度高，对检材质量要求低。5.法医学应用ＭＶＲ－ＰＣＲ序列多态性

ＭＶＲ序列称为具有变异核心序列的小卫星ＤＮＡ，是一类既有长度多态性又有序列差异性。小卫星变异重复单位作图是利用小卫星重复单位内部存在碱基差异的特点，通过酶切或特异性引物扩增的方法获得可同时检测到小卫星长度多态性和序列多态性的电泳图谱。基本原理ＭＶＲ序列的特点：同一小卫星内重复单位的核苷酸序列存在差异ＭＶＲ－ＰＣＲ利用ＰＣＲ技术既能检测小卫星因重复序列次数不同产生的长度差异，又能检测到一个等位基因内碱基序列差异在一个小卫星基因座有多个重复序列类型，不同类型核心序列的重复次数不同，不同个体的基因座的等位基因长度不同不同类型的核心序列在串联重复时，相互穿插的位置和次数不同，组成不同个体的不同模板结构。根据基因座两翼结构设计5ˊ3ˊ两条公共引物，根据不同的重复序列设计多条特异性引物。ˊ基本技术实质就是序列特异引物引导的PCR反应。序列特异引物是根据不同类型核心序列关键几处碱基的差异而设计。特异性引物仅从相应类型的核心序列起始扩增，由于该型核心序列是串联重复形式，引物可以和每个核心序列结合，串联重复不同的同一核心序列据公共引物的距离不同，由此可以产生大小不同的阶梯状扩增片段。基本分型方法ＭＶＲ－ＰＣＲ分型方法以5端侧翼区引物Y1A＋和引物TAG1进行PCR扩增获得揭示DYF1551S1正向1型核心序列为例。1模板ＤＮＡ的抽提２ＭＹＲ－ＰＣＲ选择５端侧翼区引物Ｙ１Ａ＋和引物TAG1进行PCR扩增。TAG1的５端标记６－ＦＡＭ荧光染料。３ＰＣＲ产物检测采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。或者变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，软件收集信号，处理数据。在法医学上的应用1个人识别小卫星的杂合度为99.1%，理论上只要借助MS32前50个等位基因就可以分为350个不同的等位基因。MVR-PCR分析表明：前50个等位基因的DP值3×10－11。2亲子鉴定研究表明：如使用STR基因座做亲子鉴定是出现一两个基因座不相符时，可以利用MVR-PCR分析将是判断该些位点出现假性排除的最有利的工具。

第六章第五节

测序其他技术一、DNA芯片技术一、DNA芯片技术的概念

DNA芯片技术是指采用原位合成或显微打印手段将数以万计的DNA探针固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测标记样本与探针的杂交信号强度获取样本分子的数量和序列信息，由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，且在制备的过程中运用了计算机芯片的制备技术，所以称为DNA芯片。DNA芯片又被称为基因芯片（genechips）、DNA阵列（DNAarray）、cDNA芯片（cDNAchips）、寡核苷酸阵列（oligonucleotidearray）等。DNA芯片技术的特点1强大的类比性；以往多次处理的遗传分析可在同一时间和条件下进行，具有可比性。2巨大的信息产出率;在一张芯片上可以获得组织、细胞、等基因表达信号的定性、定量分析，还可以实现全局检测静态到动态与时间差异的遗传信息。3高度灵敏性和专一性;能够检测出ＤＮＡ10pg/ul。4高度重复性;5微型化和自动化。最小芯片面积仅有1cm2DNA的原理：应用已知核酸序列作为靶基因与互补的探针核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定量和定性分析。二、DNA芯片的主要类型及其特点。

根据DNA芯片的制备方式可以将其分为两大类：原位合成芯片（syntheticgenechip）

采用显微光蚀刻等技术在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片称为原位合成芯片。这种芯片的集成度教高，可达10万～40万点阵/平方厘米。但合成的寡核苷酸探针长度较短，一般为8～20个核苷酸残基（nucleotide，nt），最长为50nt，因此需要使用多个相互重叠的探针片进行检测，才能对基因进行准确的鉴定。

DNA微集芯片（DNAmicrochips）将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片称为DNA微集芯片，又称为DNA微集陈列（DNAmicroarray）。这类芯片集成度相对较低，可达1万～10万点阵/平方厘米，但使用的探针组的来源比较灵活，可以是合成的寡核苷酸短片段，也可以是采用来自基因组的较长的DNA片段；可以是双链，也可以采用单链的DNA或RNA片段，且技术实现未受到严格的专利控制，因而近年来发展很快。探针的长度可达100～500nt。第二节DNA芯片技术的基本原理与方法一、芯片的制备芯片制备的基本原理。芯片的制备包括支持物的预处理、原位合成芯片的准备和DNA微集陈列的制备三个方面。

1.支持物的预处理目前用于DNA芯片制作的固相支持物大致可分为两类：实性材料和膜性材料。实性材料包括硅片、玻片等。膜性材料有聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维素膜等。采用原位合成或显微打印手段将数以万计的寡核苷酸片段或cDNA按顺序固化于支持物表面上。二、样品的准备

样品的准备包括样品的分离纯化、扩增和标记等过程。

1．样品的分离纯化主要从活组织或血液中获得DNA或mRNA，这个过程包括细胞分离，破裂，去蛋白，提取及纯化核酸的过程。

2．样品的扩增测定时往往需要较多的样品分子，因此对于分离获得的基因组DNA通过PCR技术直接扩增，对于mRNA则需要逆转录，制备cDNA。

3.样品的标记

标记物主要有荧光分子（cy3、cy5）、生物素以及放射性同位素等。带有标记的dNTP（cy3或cy5-dNTP、32P-dNTP、生物素-dNTP）通过DNA或cDNA扩增的过程，掺入靶分子序列。也可以在制备引物时，掺入标记的核苷酸，扩增靶序列后，使扩增产物末端带有标记物。膜性载体可以用于检测同位素标记的样品。

样品分子标记的质量影响芯片检测的灵敏度，因此，核酸的提取，反转录以及标记等各环节要求严格操作。荧光标记分辨率高于同位素标记，而且可以采用双色，如对照样品标红色，待检样品标绿色，有助于结果分析与判断。

三、分子杂交

芯片杂交是应用标记的待测样品（靶序列）与固定在载体表面的探针进行的复杂反应并产生一系列信息的过程。依据探针长度、类型以及不同的目的，确定温度、盐浓度与反应时间。通常采用的条件是：42℃，50%甲酰胺，6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt试剂。也可采用65℃，6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt试剂或者65℃，10%SDS，7%PEG-800。

杂交过程类似Northern或Southern杂交，如封闭液预杂交、杂交、清洗、干燥与检测。芯片杂交的特点是探针的量显著大于靶基因片段，杂交动力学呈线形关系。杂交信号的强弱与样品中靶基因的量成正相关。四、信号检测和结果分析

芯片杂交及清洗后，未杂交分子被清除，带有荧光标记的靶DNA（杂交分子）与其互补的DNA探针形成杂交体，在激光的激发下，荧光素发射荧光。杂交后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和软件分析图像，然后转换成数据，通过陈列上DNA探针的原始序列将靶DNA的信息反映出来。样品靶序列与探针严格配对杂交的分子发生强荧光信号，不完全杂交显示较弱的信号。

DNA芯片技术在医学领域的应用1.基因诊断

应用DNA芯片技术可以在DNA水平检测与疾病相关的内源性或外源性基因；应用表达芯片可以在mRNA水平分析同一组织在不同的发育阶段，正常及病理状态基因表达的差异，也可以分析不同组织同一基因在正常及病理状态下表达的差异，从而为疾病诊断与分类，病原微生物分型提供科学依据。2.DNA序列测定任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解成一系列碱基数固定、错落而且重叠的寡核苷酸，可以合成或应用已知序列的所有可能的n体寡核苷酸，并将其固定在芯片表面，然后与标记的待测靶序列杂交，经过重新组合，即可得到待测的DNA序列。3.临床药物筛选临床许多细菌对药物具有抗药性，但是不同的亚型对同一药物的敏感性不同。DNA芯片技术已被用于鉴定结核菌及非典型分支杆菌的基因型与耐利福平的相关性以及HIV产生抗药性与其逆转录酶及蛋白酶基因突变的相关性。这为临床选择敏感药物提供了有效手段。

4.其他领域法医鉴定方面，DNA芯片技术也将具有极大的潜力。

基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱

近年

来，利用质谱技术研究高分子聚合物结构的方法越来越受到重视。MALDI-TOFMS用于高分子聚合物检测时，具有样品用量少、分析速度快、灵敏度高、分辨率高、检测质量范围宽、分离和鉴定可以同时进行、能够给出聚合物多方面信息等优点。MALDI-TOFMS原理MALDI-TOFMS主要由基质辅助激光解吸电离离子源(MALDI)和飞行时间质量分析器(TOF)两部分组成。其原理是样品分子分散在基质分子中形成共结晶，激光照射时，基质从激光中吸收能量，传递给样品分子，使其瞬间汽化，并将质子转移到样品分子使其离子化，然后进入飞行时间质量分析器，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测。即通过离子的质量电荷比(m／z)与离子飞行时间成正比分析离子，并测得样品分子的分子量。检测ＤＮＡ样本时样本片段越短，越早到达检测器。MALDI是一种软电离技术，在线性模式下不产生或者产生很少的碎片离子，可直接应用于混合物分析，也可用来检测样品中是否含有杂原子及杂质分子量。基质的选择是成功应用MALDI技术的关键因素之一选择基质的一般规律为：1)能够强烈吸收入射光；2)低反应活性；3)较低的汽化温度；4)与分析物有较好的相溶性。基质的作用是吸收能量传递给样品分子，并保护样品分子不被强烈的激光破坏，减弱样品分子之间的相互作用。基本方法１基因组ＤＮＡ的提取：用chelex-100方法２ＰＣＲ扩增：扩增apoE基因第4外显子232bp片段。３ＰＣＲ产物纯化：用磁珠法纯化。４SNP特异的PEX反应5PEX产物的纯化6样本分析：在样本靶上点上基质晾干，再将样本点在基质上晾干，最后将靶放在基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱进行检测。采用样品中的引物峰做内标。

7数据处理及等位基因判别：软件处理数据。计算各个峰与引物峰的质量电荷比(m／z)之差，得知延伸引物碱基的类型，可判断出SNP的基因型。应用可以检测基因组SNP进行分析检测；可区分和鉴别分子质量为20多个碱基、仅有一个碱基差别的不同DNA片段。变性高效液相色谱法一种快速筛选DNA序列差异的技术DＨＰＬＣ亦称为温度调节的杂合双链分析（ＴmＨA）,其利用在部分变性条件下同源、异源双链DNA解链特征的差异进行变异检测。另外在非变性条件或完全变性条件下，还可用于分离、分析双链或单链核酸片段。基本原理在DNA混合溶液中，温度升高，DNA双链变成单链，温度逐渐减低时，根据碱基互补配对原则形成双链。复性时形成的ＤＮＡ连有同源ＤＮＡ链和异源ＤＮＡ链。根据同源ＤＮＡ链和异源ＤＮＡ链在色谱柱上保留的时间差异，可识别变异性的存在。

同源DNA链比异源ＤＮＡ链在色谱柱上保留的时间长。工作温度（柱温）是决定DＨＰＬＣ敏感性的最关键因素，将柱温升高使DNA片段开始变性，则部分变性的DNA可被较低浓度的乙腈洗脱下来。由于异源双链（错配的）DNA与同源双链DNA的解链特征不同，在相同的部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，被色谱柱保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线，此即为DＨＰＬＣ检测变异的基本原理。基本方法1模板ＤＮＡ提取；适于DＨＰＬＣ检测变异的PCR产物长度最好在200-500bp范围。2mtDNA的扩增；3样本预处理;实际分子杂交（复性）。PCR产物浓度必须足够大，要求PCR产物经琼脂糖凝胶电泳可见清晰的条带.4建立DＨＰＬＣ最佳检测温度及运行条件；在不同高温下不同DNA链先后被洗脱下来。5结果分析。如果出现一条峰，说明两条DNA片段序列相同，出现两条峰，序列不同。如有必要，可以根据保留时间差异将不同的片段分离开。在法医学上应用变性高效液相色谱法适与mtDNA多态性分析（个人识别）和SNP分析。优点：准确性好；灵敏度高；更加经济、快速。焦磷酸测序方法一种基于发光法测定焦磷酸盐（PPi)。不需电泳，适合小片段DNA序列分析。引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶四种酶的协同作用下，每一个dNTP

的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，以荧光信号的形式实时记录模板DNA核苷酸序列。焦磷酸测序的基本过程第一步，将测序引物杂交到PCR扩增的模板上，然后加入DNA聚合酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、ATP硫酸化酶及其反应底物5-磷酰硫酸APS,即S取代了ATP分子中βP原子）组成一个反应体系。第二步，将4种dNTP依次单独加入到反应体系中进行聚合酶链式反应，在DNA聚合酶作用下，当每一种dNTP与模板上相对应的核苷酸根据碱基互补配对原则进行聚合时，便会产生相同摩尔数的焦磷酸。需要说明的是，在焦磷酸测序过程中，ATP能被荧光素酶分解，对后面的荧光强度测定影响很大，而dATαP对荧光素酶分析的影响比dATP低500倍。dATαP取代dATP位置。第三步，在APS存在的情况下，APS硫酸化酶将无机焦磷酸（PPi）转移到APS上形成ATP，该ATP驱动荧光素酶将荧光素转化成氧化荧光素，同时释放出与ATP量成比例的荧光，发出的荧光信号被CCD摄像机拍摄下来，并以波峰形式被软件记录下来。每一峰高（即荧光强度）都与参与DNA合成的核苷酸数成比例。第四步，没有聚合的dNTP

、反应过剩的dNTP和ATP则迅速被反应体系中的三磷酸腺苷双磷酸酶降解，反应体系得以循环。第五步，随后加入另一种dNTP

，重复上述第二至第四步反应过程。模板序列就可以随聚合酶链式反应的进行而被实时地同步测定。

用于检测ＳＮＰ位点单倍型和mtDNAＳＮＰ多态性

由于焦磷酸测序法是基于碱基逐个延伸的原理进行测序,且产生的信号强度没有碱基种类上的差异,所以非常适合测定等位基因频率。可以将数以千计人的ＤＮＡ基因组等比例混合,然后进行ＰＣＲ扩增特定ＳＮＰ所在的ＤＮＡ片段,通过焦磷酸测序即可知道该在特定ＳＮＰ位点等位基因的频率。根据已知序列设计一对引物和一条引物。在法医学上应用微测序技术又称为引物延伸方法，是一种能进行复合分析的引物延伸分析技术。

原理：用荧光染料标记的ddNTP进行等位基因特异性引物延伸，通过电泳平台显示结果。方法：扩增，引物延伸，分析。步骤：

1PCR扩增，从人类基因座得到含SNP的模板。核酸外切酶和虾-碱性磷酸酶分别消化剩余的引物和dNTP。

2PCR扩增产物加以SNP延伸引物、四色荧光标记的ddNTP、聚合酶共同完成引物延伸。实际上，在过程中引物＋ddNTP。3荧光检测，数据分析。通过引物5端连接不同数量的T尾巴，可以同时分析多个SNP。加T目的是形成不同长度的片段，易分析。2023/1/13111实时荧光