实验酵母菌形态学观察与显微镜直接计数技术1

实验四酵母菌形态观察、测微技术、细胞计数、不同接种技术、抑菌能力观察目的要求内容原理方法结果与分析一、目的要求1.观察酵母菌的不同细胞形态（单细胞和假丝）2.观察酵母菌的繁殖方式(出芽\子囊），学习区别死活细胞的染色方法3.学习测微技术4.学习直接计数的方法。5.学习插片法培养放线菌和点植法培养霉菌。6.观察土壤芽孢杆菌抗霉菌、抗葡萄球菌能力。二、实验内容I.酵母形态观察1.肉眼观察酵母菌苔，了解酵母菌培养特性2.显微镜下观察酵母个体，认识酵母细胞形态：酵母单细胞、牙殖子、子囊孢子染色和假菌丝。II.测微技术和计数 1.用目镜测微尺和物镜测微尺，标定，测定酵母细胞大小。

2.用血球计数板用酵母菌悬液进行计数，学习直接计数法。III.实验准备1.高氏1号培养基融化倾倒，用活化的放线菌，学习放线菌的插片接种法，每2组一板。2.马丁培养基倾倒，1组1板，用活化的一种霉菌点植接种青霉菌，曲霉和根霉。3.观察土壤芽孢杆菌抑菌能力。三、实验原理1.如何区别酵母菌细胞的死活？其原理如何？2.酵母菌的生殖方式有哪些？3.酵母菌的形态有何特点？4.测微技术原理5.血球计数板的构造及用其进行微生物直接计数的原理？三、实验原理1.用什么方法区别酵母菌死活细胞？其原理如何？常用区别酵母细胞死与活的方法，是采用0.1％的吕氏美兰液染色法。活的酵母细胞由于不停地进行新陈代谢，细胞内氧化还原值颇小，还原力强，美兰染液进入细胞后，能立即还原脱色，不能被美兰液染上颜色；而死后或接近死亡的酵母细胞，不具有此还原能力，当加入美兰液后，就被美兰液染成兰色。进而达到鉴别的目的。必须指出，上述鉴别法中酵母细胞的颜色往往会受到美兰液的浓度、作用时间的影响，实际应用操作中应十分注意。BW2.酵母菌的生殖方式有哪些？1.无性生殖

芽殖酵母的种类多，主要是通过出芽的方式进行无性生殖.裂殖酵母菌通过与细菌相似的裂殖方式进行无性生殖，进行裂殖的酵母菌种类很少

。2.有性生殖 酵母菌的有性生殖方式,是指邻近两个”性别”不同的细胞,相互接触,局部融合,再通过质配,核配和减数分裂,形成4个单倍体子核,每一个子核与其附近的原生质一起,在其表面形成一层孢子壁后,就形成了一个子囊孢子,而原有营养细胞就成了子囊

BW3.酵母菌的形态有何特点？

大多数酵母菌为单细胞，形状因种而异。基本形态为球形、卵圆形、圆柱形或香肠形。有些酵母菌(热带假丝酵母，Candidatropicalis)进行一连串的芽殖后，长大的子细胞与母细胞并不立即分离，其间仅以狭小的接触面相连，这种藕节状的细胞串称为“假菌丝”

(图)。（如果细胞相连，且其间的横截面积与细胞直径一致，这种竹节状的细胞串称真菌丝。如霉菌菌丝等）。

BW子囊孢子染色孢子壁厚不易着色，但是一旦着色就很难被脱色。因此先用强染色剂（孔雀绿）下染色，使染料进入菌体和孢子，水洗时菌体中染色被洗脱而孢子中染料保留。在用对比度大的复染色剂染色后，菌体染上复染色剂的颜色而孢子保留原来颜色，这样可将两者区别开来。制片，取在28℃培养7d斜面培养物涂片，并干燥固定孔雀绿染2min,水洗，95%乙醇脱色，番红染1min,水洗干燥，4、测微技术

测微尺分目镜测微尺和物镜测微尺。目镜测微尺是一块圆形玻片，刻度随着使用的目镜和物镜的放大倍数而改变,用前必须用物镜测微尺来标定。物镜测微尺为一块特制的载玻片，其中央有一小圆圈。圆圈内刻有分度，将长1mm的直线等分为100小格，每小格等于10μm。物镜测微尺目镜测微尺测微技术-标定先用低倍镜观察，对准焦距，待看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与物镜测微尺的刻度相平行，并使两尺的左边第一条线相重合，再向右寻找两尺的另外一条重合线。目镜测微尺每格长度=两个重叠刻度间物镜测微尺格数×10/两个重叠刻度间目镜测微尺格数。5、显微镜计数技术活菌计数法：平板菌落计数法。通过培养活菌，形成菌落而计数。总菌计数：显微计数法。适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。显微镜计数技术血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图5-2）。显微镜计数技术计数区的刻度有两种：一种是计数区分9个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成16个中方格；另一种是一个计数区分成25个中方格（大方格之间用双线分开）。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。显微镜计数技术计数区边长为1mm，则计数区的面积为lmm2盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3。

使用血球计数板计数时，先要测定每个中方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。计算公式：(1)16中格×25小格的血球计数板计算公式:

细胞数/ml=每中格内细胞个数×16×104×稀释倍数

(2)25格x16格的血球计数板计算公式:

细胞数/ml=每中格内细胞个数×25×104×稀释倍数四、实验方法一）酵母菌形态观察：(1)酵母菌菌落观察：观察菌落表面干燥或润湿、隆起形状、边缘整齐度、大小、颜色等，并用接种环挑菌，注意与培养基结合是否紧密。(2)个体形态观察：用美兰浸片观察啤酒酵母菌/红酵母的基本细胞形态、芽殖子、区别死活细胞。方法：在载玻片中央加一滴美兰溶液，取少量啤酒酵母置于其中，使菌体与染色液混合均匀，将盖片斜置，慢慢放下盖在液滴上，以免产生气泡。用高倍镜观察（不用油镜）即可。（3）假丝酵母假菌丝的观察：用水浸片观察假丝酵母的假菌丝。四、实验方法二）测微技术1、取下接目镜，旋下目镜上的目透镜，将目镜测微尺放入接目镜的中隔板上，使有刻度一面朝下，再旋上目透镜，装入镜筒内。2、将物镜测微尺置于显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上，同观察标本一样，使具有刻度的小圆圈位于视野中央。3、目镜测微尺刻度的标定4、记录二条重合线间的目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。计算目镜测微尺的刻度。

5、酵母水浸片的制备观察、测大小。四、实验方法三）计数技术：计数过程及原则：

(1)准备：镜检计数室，熟悉其结构；样品稀释（目的是便于酵母菌悬液的计数）.(2）将血球计数板用擦镜纸擦净或吹干,在计数室上加盖玻片.(3）将提供的稀释10倍的酵母菌悬液混匀,用吸管尽可能快地吸取一滴置于盖玻片的边缘,使菌液缓缓渗入,静置5min以上，使酵母菌全部沉降到血球计数室内.(4)计数时,如果使用16中格×25小格规格的计数室,取对角线顶位（左上,右上,左下,右下）4个中格的酵母菌数.如果规格为25中格×16小格的计数板,除取其4个对角位外,还需再数中央的一个中格的酵母菌数.对每个样品计数三次,取其平均值,取均值。四、实验方法三）计数技术：(5)当细胞位于中格线上，采用“上计下不计，左计右不计”原则.(6)遇到有芽体的酵母时，若芽体≥1/2母体，认为芽体=1。（7）按照以上各均值，计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数.（8）血球计数板的清洁：血球汁数板使用后,用自来水冲洗,切勿用硬物洗刷,洗后自行晾干或用吹风机吹干,或用95%的乙醇,无水乙醇等有机溶剂脱水使其干燥.通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物.若不干净,则必须重复清洗直到完全洁净为止.四、实验方法四）插片接种法融化高氏1号培养基，倾倒平板。冷凝。将浸泡于酒精中的盖玻片用酒精燃烧法灭菌、冷却，45度倾角插入培养基。接种环取放线菌孢子，沿插片接缝处划线接种。每人练习1片，共用培养基。每2组共用一平板。每板插片4片一半同学接种天蓝色放线菌，另一半同学接种白色放线菌四、实验方法五）点植法接种霉菌融化马丁氏培养基，倾倒平板。冷凝。无菌接种法点植霉菌，每个平板点植4点。每种霉菌只能点植在同一个平板上。每1组1板，每人点植1点。1/3组点植青霉菌1/3组点植曲霉1/3组点植根霉四、实验方法六）芽孢杆菌的保存和验证

-观察抑菌圈大小-保存菌种-重复实验五、结果与讨论1.绘图说明酵母菌各形态观察结果。2.列表记录各计数原始值，依此计算所提供菌悬液中酵母菌的浓度。3.你每次取样的计数结果差异大吗？如果比较大，试分析原因。示教