乙肝病毒DNA的实验室检测

乙肝病毒DNA的实验室检测第一页，共二十四页，2022年，8月28日1、荧光定量PCR技术2、乙肝病毒的感染3、HBV-DNA与临床第二页，共二十四页，2022年，8月28日荧光定量PCR技术第三页，共二十四页，2022年，8月28日荧光定量PCR技术Polymerasechainreaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热酶（TaqDNA聚合酶）的作用，经过高温变性、低温退火、适温延伸三个步骤在3个小时内反复循环25-30次，把特定的DNA片段扩增1000万倍。每个PCR体系含4种主要成分：含有待扩增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核酸三磷酸（dNTP）第四页，共二十四页，2022年，8月28日

实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧光标记，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过标准曲线对PCR终产物的分析，最终实现对未知的起始模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的核酸测定中最灵敏的方法。荧光定量PCR技术第五页，共二十四页，2022年，8月28日PCR反应过程5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’反应组分变性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’第六页，共二十四页，2022年，8月28日延伸5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’3’TaqTaq5’5’重复退火第七页，共二十四页，2022年，8月28日5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’循环24个拷贝循环38个拷贝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’第八页，共二十四页，2022年，8月28日荧光定量PCR原理插入染料法

SYBRGreenI杂交探针法(最常用)

TaqMan第九页，共二十四页，2022年，8月28日TaqMan探针5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’反应体系变性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’Taql5’3’RQProbe5’3’RQ第十页，共二十四页，2022年，8月28日5’3’5’3’5’3’RQ退火5’3’1.链取代Taq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’2.水解3.聚合5’3’QTaqR3’5’4.检测荧光5’3’3’QTaqR5’l第十一页，共二十四页，2022年，8月28日乙肝病毒的感染第十二页，共二十四页，2022年，8月28日乙肝病毒的感染

（一）乙型肝炎病毒结构及特点HBsAg：是HBV感染的主要标志HBsAb：保护性抗体HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内，一般不存在于血循环中HBcAb:非保护性抗体，HBcAb-IgM提示HBV处于复制状态HBeAg：HBV复制及强感染性的指标HBeAb：有一定的保护作用，预后良好第十三页，共二十四页，2022年，8月28日乙肝病毒的感染（二）HBV-DNA与“两对半”1.“两对半”：机体的免疫反应状态；2.“携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能反应体内病毒复制水平与感染程度。FQ-PCR：检测的是HBV本身的遗传物质—DNA，是病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。HBsAg(－)

HBV-DNA(＋)

HBeAg(－)HBV-DNA(＋)3.血清学指标(－)不能排除HBV感染。第十四页，共二十四页，2022年，8月28日乙肝病毒的感染5.HBeAg阳性标本HBVDNA检出率90％左右

HBeAg与HBVDNA有着良好的相关性4.也可能出现HBsAg(＋)，HBV-DNA(－)。第十五页，共二十四页，2022年，8月28日乙肝病毒的感染HBVDNAHBVDNA贯穿感染者的终生，是评价病毒复制的金标准ALT正常增高或者波动正常增高或者波动免疫耐受期免疫清除期非活动或低（非）复制期再活动期肝组织学无明显异常,或轻度炎症纤维化中度或严重炎症、纤维化快速进展无炎症或仅有轻度炎症中度或严重炎症、肝纤维化临床诊断慢性HBV携带者HBeAg阳性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化非活动性HBsAg携带者HBeAg阴性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化第十六页，共二十四页，2022年，8月28日乙肝病毒的感染慢性HBV感染分期及相关实验室检测指标鲁凤民，庄辉，乙型肝炎实验室诊断研究进展2009第十七页，共二十四页，2022年，8月28日HBV-DNA与临床第十八页，共二十四页，2022年，8月28日HBVDNA检测的临床意义HBVDNA是HBV存在最直接的依据HBVDNA是HBV复制的标志HBVDNA是患者具有传染性的标志HBVDNA对乙肝两对半起补充作用HBVDNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标HBVDNA可检测出隐匿性慢性乙型肝炎第十九页，共二十四页，2022年，8月28日

PCR检测“窗口期”核酸检测缩短的“窗口期”的天数HBV566-15HCV7041-60HIV2210-15有利于献血员窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断提供直接证据缩短“窗口期”HBVDNA检测的临床意义第二十页，共二十四页，2022年，8月28日

调查表明并不是所有“大三阳”的病人都处于HBV复制期，具有传染性；也不是所有“小三阳”的病人HBV都无复制。因此，要准确知道HBV是否处于复制状态，最准确的方法还是通过检测HBVDNA来决定。HBVDNA检测的临床意义第二十一页，共二十四页，2022年，8月28日第二十二页，共二十四页，2022年，8月28日第二十三页，共二十四页，2022年，8月28日HBVDNA检测的临床意义