免疫学方法及其应用修改

免疫学方法及其应用修改第一页，共六十六页，2022年，8月28日病原微生物感染机体对抗免疫免疫学几个基本概念免疫(immunity)：是人和动物机体的一种保护性反应，其作用是“识别”和排除抗原性“异物”，以维持机体生理的平衡和稳定。免疫学：研究机体自我识别和对抗原性异物排斥反应的一门科学。传统的免疫概念：机体抵抗病原微生物的能力，即抗传染免疫1.免疫和免疫学第二页，共六十六页，2022年，8月28日2.免疫系统免疫系统：具有自身的运行机制并可与其他系统相互配合、相互制约，共同维持机体在生命过程中总的生理平衡。免疫系统的任务是消灭“异己”“异己”来自两个方面:外来的入侵者：侵入身体的各种致病菌包括哪些？(2)“变坏了的”自身细胞。细胞癌变第三页，共六十六页，2022年，8月28日免疫系统的生理功能①免疫防御——机体排斥外源性抗原异物的能力。②免疫自稳——机体识别和清除自身衰老残损的组织、细胞，维持正常内环境稳定。③免疫监视——机体杀伤和清除异常突变细胞，机体监视和抑制恶性肿瘤在体内生长。第四页，共六十六页，2022年，8月28日(1)探针带来细菌入侵(2)吞噬细胞赶赴“现场”(3)消灭入侵恢复健康第五页，共六十六页，2022年，8月28日

机体防御机制人体第一道防线———天然免疫(非特异性免疫)屏障结构、非特异性免疫细胞和免疫分子组成。人体第二道防线———获得性免疫(特异性免疫)分类：体液免疫细胞免疫第六页，共六十六页，2022年，8月28日

抗感染免疫的构成因素天然免疫与获得性免疫的关系◆在抗感染免疫过程中，天然免疫与获得性免疫相互依赖与协作，共同发挥消除病原微生物感染的作用。第七页，共六十六页，2022年，8月28日吞噬细胞的吞噬和杀菌过程示意图第八页，共六十六页，2022年，8月28日第三节特异性免疫包括两个基本内容：（1）免疫原性：抗原刺激有机体产生特异性免疫反应的能力；（2）反应原性：抗原与相应抗体在体内或体外发生特异性结合反应的能力；抗原性：免疫原性和反应原性的统称。

三免疫分子及其在体液免疫中的作用㈠、抗原与抗体简介抗原(antigen)

定义：凡是能刺激有机体(人或动物体)产生抗体，并能与相应抗体发生特异性结合的物质。第九页，共六十六页，2022年，8月28日(一)、抗原1、抗原的基本性质（1）异物性（2）大分子量（3）特异性

抗原刺激机体后只能产生相应的抗体并能与之结合。

特异性是由抗原表面的抗原决定基(簇)决定的。

抗原决定基（表位）：抗原分子中决定抗原特异性的基本结构或具有化学活性的基团。抗原决定基是与抗体特异性结合的基本单位。（4）化学结构复杂免疫原性的形成还要求蛋白质分子的化学结构复杂。极性基团愈多或含支链氨基酸愈多，以及带芳香族氨基酸多的蛋白质抗原性愈强。

第十页，共六十六页，2022年，8月28日2、抗原的种类按抗原性的完整与否及其在机体内刺激抗体产生的特点，可分为完全抗原和不完全抗原。（1）完全抗原与不完全抗原①完全抗原既有免疫原性又有反应原性。即能刺激机体产生抗体，并与产生的抗体在体内或体外(试管内)发生反应的抗原。

如细菌、病毒、外毒素、血清白蛋白、花粉蛋白、②不完全抗原（半抗原）只有反应原性而没有免疫原性。即不能单独刺激机体产生抗体，若与蛋白质或胶体颗粒结合，形成大分子复合物成为完全抗原，则可刺激机体产生抗体。

如各种低分子量的药物、脂类和多糖等都属于不完全抗原。第十一页，共六十六页，2022年，8月28日（2）细菌抗原第十二页，共六十六页，2022年，8月28日①菌体抗原（O抗原）在细胞壁上，主要抗原。主要成分为脂多糖。根据O抗原的组成不同进行分群。O抗原耐热，121℃，2h不被破坏。如沙门氏菌属的O抗原不同分成67个血清群。

②鞭毛抗原（H抗原）在鞭毛中，由蛋白质组成，具有不同的种和型特异性，可作菌型鉴别。H抗原不耐热，56～80℃，30～40min即被破坏。在制备O抗原时常用煮沸法消除H抗原。2、抗原的种类（2）细菌抗原第十三页，共六十六页，2022年，8月28日③表面抗原（表面抗原）包围在细菌细胞壁最外面，故称。表面抗原随菌种和结构的不同可有不同的名称。如肺炎链球菌——荚膜抗原；大肠杆菌、痢疾志贺氏菌——包膜抗原或K抗原，沙门氏菌属——Vi抗原等。④菌毛抗原

存在于菌毛中的抗原，也具有特异的抗原性。⑤外毒素和类毒素

细菌外毒素具有很强的抗原性，能刺激机体产生抗毒素抗体。外毒素经0.3%～0.4%甲醛溶液处理后使其失去毒性，但仍保持抗原性，即成为类毒素。2、抗原的种类（2）细菌抗原第十四页，共六十六页，2022年，8月28日(二)、抗体(antibody,Ab)定义：抗原刺激有机体(人或动物)所产生的具有特异性的免疫球蛋白。抗体是由B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一类糖蛋白，能与相应抗原表位结合，是介导体液免疫的重要免疫分子。分泌型(secretedIg,sIg)：膜型(membraneIg,mlg)：在血清和组织液中，占全部机体血清的20%～25%。具有抗体的各种免疫功能是B细胞表面的抗原受体。含有免疫球蛋白的血清，称为免疫血清或抗血清。第十五页，共六十六页，2022年，8月28日(二)、抗体1、抗体的性质（1）免疫球蛋白是一种糖蛋白，具有蛋白质的通性。凡能破坏球蛋白的各种理化因素均能使之灭活；能被多种蛋白水解酶裂解；可以在乙醇、三氯醋酸或中性盐类中沉淀，生产上常用50%饱和硫酸铵或硫酸钠从免疫血清中提取抗体球蛋白。（2）在体外(试管内)，抗体可与相应的抗原发生特异性结合并出现可见反应；在体内，与其他防御机能协同作用下杀灭病原菌，起到抗感染作用。但某些抗体在机体内与相应的抗原相遇时，能引起变态反应。如青霉素过敏等。第十六页，共六十六页，2022年，8月28日（3）由不同细胞克隆产生的抗体具有不均一性和结构的多样性。

例如将血清电泳时，免疫球蛋白主要分布于γ球蛋白区，因而曾称抗体为γ球蛋白，也有少量延伸到β区和α2区。抗体作为一种球蛋白，对异种动物又是很好抗原。因此,抗体即是抗体，又是抗原。利用此种特性可以制备抗免疫球蛋白抗体(或称抗抗体)，用于荧光抗体技术中(间接法)。1、抗体的性质第十七页，共六十六页，2022年，8月28日2、抗体的基本结构两条重链(H链)两条轻链(H链)440个氨基酸残基组成，分子量约50～70kD220个氨基酸组成，分子量约22.5kD。二硫键(-S·S-)根据重链的氨基酸顺序同源程度的差异，可将Ig分为类和亚类。人的免疫球蛋白共5类：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE第十八页，共六十六页，2022年，8月28日2、抗体的基本结构N端可变区恒定区键间二硫键轻链重链C端CDR区识别抗原构架区第十九页，共六十六页，2022年，8月28日2、抗体的基本结构第二十页，共六十六页，2022年，8月28日①免疫抗体3、抗体的种类

（1）根据抗体获得方式分类②天然抗体③自身抗体（2）根据抗体作用对象分类①抗菌性抗体②抗毒性抗体③抗病毒性抗体④过敏性抗体动物患传染病后或经人工注射疫苗后产生动物先天就有的抗体，可以遗传给后代

机体对自身组织成分产生的抗体

细菌或内毒素刺激机体所产生的抗体

细菌外毒素刺激机体产生的抗体

病毒刺激机体而产生的抗体，阻止病毒侵害异种动物血清进入机体后所产生的使动物发生过敏反应的抗体

第二十一页，共六十六页，2022年，8月28日4、人工制备抗体（1）多克隆抗体(polyclonalantibody，PoAb)定义：

将抗原免疫动物，刺激动物体内多个B细胞克隆产生的抗体，是针对多种抗原决定基的混合抗体。特点：来源广泛、制备容易，但不易大量制备；特异性不高，常出现交叉反应；评价：应用受到限制。第二十二页，共六十六页，2022年，8月28日4、人工制备抗体（2）单克隆抗体(monoclonalantibody，McAb)

原理:淋巴细胞增殖分化的浆细胞

(来自脾脏，有抗原特异性,能产生抗体，但短寿)

骨髓瘤细胞

(无抗原特异性，但长寿，能在体外无限繁殖)

利用原生质体融合技术进行细胞融合，

获得既能在体外培养又能产生单一抗体的杂交瘤细胞。特点：纯度高、特异性强、效价高、无或少血清交叉反应，制备成本低等特性。已广泛用作临床诊断试剂或生化治疗剂。

第二十三页，共六十六页，2022年，8月28日4、人工制备抗体单克隆抗体制备示意图第二十四页，共六十六页，2022年，8月28日单克隆抗体制作过程第二十五页，共六十六页，2022年，8月28日4、人工制备抗体（2）单克隆抗体(monoclonalantibody，McAb)

应用：已广泛用作临床诊断试剂或生化治疗剂。

①对微生物病原体的鉴定。②特异性抗原或肿瘤相关蛋白质的检测和鉴定。③疾病的被动免疫治疗和生物导向药物的制备。④检测血液中的药物含量。⑤分离某些昂贵的生物活性物质。

第二十六页，共六十六页，2022年，8月28日4、人工制备抗体（3）基因工程抗体（重组抗体）在基因水平上对Ig分子进行切割、拼接或修饰，重新组装成的新型抗体分子。。特点：保留天然抗体的特异性和主要生物学活性，去除或减少了无关结构，并可赋予抗体分子以新的生物学活性。迄今已成功构建多种基因工程抗体，如人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体(ScFv)、双特异性抗体(BsAb)及噬菌体抗体等。

第二十七页，共六十六页，2022年，8月28日一.抗原与抗体反应的一般规律抗原抗体反应：抗原与相应抗体之间在体内或体外所发生的特异性结合反应。体内反应：介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；体外反应：根据抗原的物理性状、抗体的类型及参与反应的介质不同，可出现凝集反应、沉淀反应、补体结合反应及中和反应等各种不同的反应类型。因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多用血清作试验，故体外抗原抗体反应亦称为血清学反应。第四节免疫学方法及其应用第二十八页，共六十六页，2022年，8月28日抗原抗体反应的一般特点1.特异性与交叉性

特异性：一种抗原只能与它相应的抗体结合。交叉性：两种不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、抗体间构型部分相同，就可出现交叉反应。2.可逆性

抗体与抗原的结合是分子表面的一种物理结合即非共价键的结合，在一定条件下可以发生解离。分开后，二者的性质不变。3.定比性

抗原物质是多价的；抗体是双价的。抗原抗体的结合是抗原—抗体—抗原—抗体这样顺次结合，只有当两者比例合适时，聚集成较大的复合物才能出现可见反应。第二十九页，共六十六页，2022年，8月28日抗原抗体反应的一般特点3.定比性图7-4沉淀反应的曲线每一个Y字形的Ig单体分子能结合2个抗原表位，称之为两价；分泌型IgA为4价；五聚体IgM理论上为10价，但由于立体构型的空间阻位，一般只能结合5个抗原表位。第三十页，共六十六页，2022年，8月28日抗原抗体反应的一般特点4.阶段性

第一阶段：发生特异性反应，特点是反应快，不被肉眼所见。第二阶段：可见阶段，是非特异性的。反应较慢，受到电解质、pH值和温度的影响。5.敏感性

高度的敏感性，用于定性，还可用于定量和定位。第三十一页，共六十六页，2022年，8月28日影响抗原抗体反应的因素1.电解质4.杂质异物0.85％的NaCl生理盐水2.温度37℃水浴3.pH值多数血清学反应的适宜pH值为6～8第三十二页，共六十六页，2022年，8月28日二、抗原、抗体间的主要反应1、凝集反应2、沉淀反应3、免疫电泳4、补体结合实验

第三十三页，共六十六页，2022年，8月28日三、主要抗原抗体反应(一)、凝集反应

定义：颗粒性抗原与相应的抗体在有电解质合适条件下反应并出现肉眼可见的凝集团现象。（凝集原，凝集素）一般稀释抗体(抗血清)，使其与抗原有一合适比例。1直接凝集反应①玻片法

定性试验。用已知抗体检测未知抗原。

用途：鉴定菌种，菌种分型，测定ABO血型等。

②试管法

定量试验。用已知抗原测定血清中抗体有无及相对含量发生明显凝集现象的最高血清稀释度（抗体效价，滴度

)，以表示血清中抗体的相对含量。

用途：测定患传染病的人或家畜血清中的抗体，诊断第三十四页，共六十六页，2022年，8月28日三、主要抗原抗体反应2.间接凝集反应定义：利用某些与免疫无关的均一的小颗粒物质作为载体，将可溶性抗原(或抗体)吸附于表面，如与相应的抗体

(或抗原)结合，在有电解质存在的适宜条件下，发生凝集现象。表面吸附抗原(或抗体)的载体微球称为免疫微球。特点：增大体积，敏感，可检测极微量抗原。根据所用载体不同，常用的间接凝集反应有间接血球凝集反应，碳凝集反应，乳胶凝集反应等。还有间接凝集抑制反应，第三十五页，共六十六页，2022年，8月28日第三十六页，共六十六页，2022年，8月28日三、主要抗原抗体反应(二)、沉淀反应定义：可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电解质存在条件下，形成肉眼可见的沉淀物。（沉淀原，沉淀素）

凝集反应与沉淀反应的区别：凝集反应的抗原是颗粒性抗原，总表面积小，做抗体稀释。沉淀反应的抗原是可溶性的胶体溶液，单位面积抗原多，需抗体量多，抗原稀释。

以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。类型：环状法、絮状法和琼脂扩散法（单向和双向）。第三十七页，共六十六页，2022年，8月28日三、主要抗原抗体反应图7-5琼脂双向扩散的几种不同方式结果示意图第三十八页，共六十六页，2022年，8月28日3、免疫电泳将琼脂扩散和电泳技术相结合的血清学检验方法。

特点：特异性强、很高的灵敏性和分辨力。用途：分析抗原或抗体纯度。

类型：对流免疫电泳、火箭电泳、双向免疫电泳、琼脂免疫电泳。（1）对流免疫电泳这是一种将双向扩散与电泳技术结合而成的方法。

原理：抗原与抗体分别置于凝胶板电场负、正极附近的小孔中，通电后，抗原向正极移动，而抗体则向负极移动，结果在两孔间合适的抗原、抗体浓度处会形成一条沉淀线。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和甲种胎儿蛋白(AFP)等的检测。第三十九页，共六十六页，2022年，8月28日3、免疫电泳（2）火箭免疫电泳定义：抗原在含定量抗体的琼脂中向一个方向泳动，两者比例合适时，在较短时间内生成如火箭状或锥状的沉淀线。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。图7-6火箭电泳结果示意图第四十页，共六十六页，2022年，8月28日（3）双向免疫电泳这是一种将火箭电泳与血清免疫电泳相结合的方法定义：先将血清用电泳分离出各成分，然后切下凝胶板转移至另一已加有抗血清的凝胶上，进入垂直方向的第二次电泳，形成呈连续火箭样的沉淀线。

图7-7双向免疫电泳示意图

第四十一页，共六十六页，2022年，8月28日3、免疫电泳（4）琼脂免疫电泳先进行琼脂平板电泳再做双向琼脂扩散的血清学检验技术。定义：先将抗原样品在琼脂凝胶中电泳，不同抗原成分因其迁移率的不同而分离成区带，挖一条平行的抗体槽，加入抗血清做双向扩散，在两者比例适合处形成可见的弧形沉淀线。根据沉淀线的数量、位置和形状，即可分析样品中所含的抗原成分和含量。琼脂免疫电泳示意图第四十二页，共六十六页，2022年，8月28日(三)、补体结合实验定义：有补体参与，并以绵羊红血球和溶血素(红细胞的特异抗体)是否发生溶血反应作指示的一种高灵敏度的抗原与抗体结合反应。原理：补体没有特异性，可与任何抗原抗体复合物发生结合(即不能与单独的抗原或抗体结合)，一旦结合后并不再游离，但不能显示肉眼可见现象。通常应用溶血系统作为指示剂，以判定补体是否已被抗原抗体复合物结合。游离补体，就会出现肉眼可见的溶血反应。补体结合试验有抗原、抗体、补体、红血球、溶血素5种成分参加，并分属于反应系统和指示系统。第四十三页，共六十六页，2022年，8月28日4、补体结合实验

图7-9补体结合实验示意图

第四十四页，共六十六页，2022年，8月28日4、补体结合实验（1）反应系统(试验系统、结合系统)

由已知抗原(或抗体)、被检抗体(或抗原)和补体组成。先加入抗原、抗体，再加入补体，混合后作用一定时间。如果抗原和抗体相对应，形成抗原抗体复合物，则补体就被结合，否则即为游离状态。（2）指示系统(溶血系统)由红血球(抗原)和溶血素(抗体)组成。在反应系统完毕后，再向试管内加入绵羊红血球和溶血素。不发生溶血：补体被抗原抗体复合物结合，阳性反应。发生溶血：液体中的抗原抗体不相对应，没有发生结合，补体依然游离存在，反应阴性。第四十五页，共六十六页，2022年，8月28日三、免疫标记技术现代免疫学技术包括免疫标记技术、免疫定位分析、免疫亲和层析和免疫生物传感器技术等，其中尤以免疫标记技术发展最快，应用最广。免疫标记技术：将某些小分子物质作为标记剂（如荧光素、酶、放射性同位素或电子致密物质等）结合到抗原或抗体上，不抗原抗体反应，更容易观察，提高检测的灵敏度。标记剂：与抗原或抗体结合的小分子物质。优点：特异性强，灵敏度高，应用范围广，反应速度快，容易观察；既可用于定性、定量分析，又可用于分子定位等工作

第四十六页，共六十六页，2022年，8月28日现代免疫技术免疫标记技术1、免疫荧光技术2、免疫酶技术3、放射免疫测定法4、免疫电镜技术第四十七页，共六十六页，2022年，8月28日定义：一种将结合有荧光素的荧光抗体与抗原反应，以提高免疫反应灵敏度和适合显微镜观察的免疫标记技术。荧光素浓度在10-8时，仍可受激发而射出肉眼可见的荧光。原理：在一定条件下以化学方法将荧光素与抗体结合，制成荧光素抗体，但不影响抗体的免疫活性。如果标本中的抗原与荧光素抗体结合着染后，在荧光显微镜下成为发出荧光的可见物体，即可达到检出抗原的目的。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)和罗丹明(RB200)，在蓝紫光激发下，分别发出鲜明的绿色荧光和橙黄色荧光。基本方法：直接法，间接法、补体结合法和标记法。(一)、免疫荧光技术（荧光抗体法）第四十八页，共六十六页，2022年，8月28日(一)、免疫荧光技术（荧光抗体法）（1）直接法（2）间接法（3）补体结合法（4）标记法图7-10免疫荧光抗体法原理示意图第四十九页，共六十六页，2022年，8月28日直接免疫荧光法第五十页，共六十六页，2022年，8月28日间接接免疫荧光法第五十一页，共六十六页，2022年，8月28日

免疫荧光技术基础上发展起来的血清学检验方法。一种酶作标记的抗体或抗抗体的高灵敏度的免疫标记技术。原理：利用酶与抗原或抗体结合后，既不改变抗原或抗体的疫学反应特异性，也不影响酶本身的活性，在特异抗原抗体反应后，于相应而合适的酶底物作用下，产生可见的不溶性有色产物。与免疫荧光技术区别：有色的沉淀物可在光学显微镜下进行细胞水平的抗原追踪，也可在电子显微镜下进行分子水平的观察，又能用分光光度计定量测定酶作用底物分解的量。(二)、免疫酶技术（酶免疫测定技术）目前常用辣根过氧化物酶(HRP)，也有用碱性磷酸酶标记抗体第五十二页，共六十六页，2022年，8月28日(二)、免疫酶技术（酶免疫测定技术）1.酶联免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbantassay，ELISA，酶标法)ELISA是目前应用最广泛的生物学技术之一。原理：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。ELISA试验中需要有3种试剂：①固相的抗原或抗体。目前多用聚苯乙烯酶标板(微量滴定板)作为固相载体②酶标记的抗原或抗体。③酶作用的底物。第五十三页，共六十六页，2022年，8月28日抗原捕获ELISA第五十四页，共六十六页，2022年，8月28日1、把抗体固定在固相支持物上（96孔板）；2、加入蛋白质样品保温，再洗去未结合的杂蛋白；3、加入第二抗体，第二抗体结合一个供检测用的酶（辣根过氧化物酶）4、洗去未结合第二抗原，酶活测定。第五十五页，共六十六页，2022年，8月28日第五十六页，共六十六页，2022年，8月28日ELISAforHIVantibody

MicroplateELISAforHIVantibody:colouredwellsindicatereactivity第五十七页，共六十六页，2022年，8月28日(二)、免疫酶技术（酶免疫测定技术）1.酶联免疫吸附法优点：①灵敏度高，特异性强。②酶标抗体制备容易，且高度稳定而有效期长。③操作简便④应用范围广泛。

ELISA技术用于检测多种病原菌抗原或抗体、血液及其他体液中微量蛋白成分、细胞因子等。在食品加工领域，ELISA技术可用于测定蛋白质，也可用于测定各种生物活性成分，如异黄酮半抗原。在食品安全方面，用于检测食品中农药残留，以及检测食品中的病原菌及其毒素，如沙门氏菌及其内毒素和肠毒素、大肠杆菌及其肠毒素和肠细胞出血毒素、金黄色葡萄球菌及其肠毒素、霉菌和真菌毒素。第五十八页，共六十六页，2022年，8月28日1.酶联免疫吸附法ELISA方法：将可溶性抗体或抗原吸附到聚苯乙烯等固相载体上，再滴加酶标记的抗原或抗体，然后添加底物，进行免疫酶反应，以酶标仪测定。①双抗体夹心法本法用于检测抗原。图7-11双抗体夹心法测抗原示意图

标本（含抗体）酶标抗体

底物

固相抗体第五十九页，共六十六页，2022年，8月28日1.酶联免疫吸附法②间接法

图7-11间接法测抗原示意图

标本（含抗体）酶标抗体

底物

固相抗原第六十页，共六十六页，2022年，8月28日1.酶联免疫吸附法③斑点酶免疫吸附法(dot-ELISA)本法原理与上述两法相同，方法上的不同之处是：A用硝酸纤维薄膜取代上述微量滴定板；B最终显色反应是不溶于水的有色沉淀物，例如，碱性磷酸酶的底物不能用对硝基酚磷酸盐，而要用氮蓝四唑(NBT)等。最终可从薄膜上沉淀物颜色的有无或多少确定结果。优点：灵敏度高(比普通ELISA高10～100倍)，与放射免疫测定相当。第六十一页，共六十六页，2022年，8月28日1.酶联免疫吸附法④生物素-亲和素系统（BAS)在ELISA中的应用

亲和素是存在于蛋清中的碱性糖蛋白，一个亲和素分子由4个亚基组成，可与4个生物素分子稳定结合；生物素是存在于蛋黄中的维生素H