可见分光光度法和

可见分光光度法和第一页，共四十五页，2022年，8月28日

分光光度法是根据物质的吸收光谱及光的吸收定律，借助分光光度计对物质进行定性、定量分析的一种方法。根据测定时所用的光源波长的不同，分光光度法可分为可见分光光度法、紫外分光光度法和红外分光光度法等几种。

第二页，共四十五页，2022年，8月28日可见分光光度法

（380－780nm)紫外分光光度法

（10－380nm)红外分光光度法

（780－3×105nm)分光光度法第三页，共四十五页，2022年，8月28日

与滴定分析方法相比，分光光度法灵敏度高，被测物质浓度的下限可达到10-5~10-6mol•L-1，因而适用于微量及痕量成分含量的测定，是当前医药、卫生、环保、化工等部门常用的分析方法之一。第四页，共四十五页，2022年，8月28日第一节基本原理一、光的性质与物质的颜色二、Lambert-Beer定律第五页，共四十五页，2022年，8月28日一、光的性质与物质的颜色

当一束光照射在某物质或某溶液时，组成该物质的分子、原子或离子等粒子与光子作用获得能量，从低能量状态跃迁到高能量状态，即由基态转变为激发态，这个过程即是物质对光的吸收。

M(基态)＋hν

→M*(激发态）第六页，共四十五页，2022年，8月28日第七页，共四十五页，2022年，8月28日

不同物质的基态和激发态的能量差不同，选择吸收光子的能量也不同，即吸收光的波长不同。光的能量与波长成反比，波长越短，能量越高。第八页，共四十五页，2022年，8月28日

单一波长的光称为单色光，由不同波长组成的光称为复色光。白光（日光等）就是一种复色光，它是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等颜色的光按一定的强度比例混合而成。若两种颜色的光按照适当的强度比例混合可成白光，则这两种光称为互补色光。第九页，共四十五页，2022年，8月28日

处于同一直线上的两种色光为互补光，见下图：

从图中可以看到，蓝光与黄光互补，青光与红光互补等第十页，共四十五页，2022年，8月28日

物质对光的吸收具有选择性，若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈现出吸收光的互补光的颜色。

如CuSO4溶液选择性地吸收白光中间的黄色光，故CuSO4溶液呈蓝色。

[Fe(SCN)6]3-呈血红色，说明其溶液选择性地吸收白光中的青色光。

如果溶液对所有颜色的光都不吸收，则溶液表现为无色透明；如溶液对所有颜色的光全部吸收，则溶液呈黑色。第十一页，共四十五页，2022年，8月28日物质呈现的颜色吸收光颜色波长范围（nm)黄绿紫380－435黄蓝435－480橙黄绿蓝480－500红紫绿500－560紫黄绿560－580蓝黄580－595绿蓝橙595－650蓝绿红650－760第十二页，共四十五页，2022年，8月28日第二节分光光度法基本原理一、透光率和吸光度二、Lambert-Beer定律第十三页，共四十五页，2022年，8月28日二、Lambert-Beer定律（一）透光率和吸光度IoItb有色溶液

当一束平行的单色光照射到有色溶液时，一部分光被溶液吸收，剩余部分则透过溶液。第十四页，共四十五页，2022年，8月28日

若入射光的强度为Io，透过光的强度为It，则透射光的强度It与入射光强度Io之比称为透光率，用T表示：

透光率越大，溶液对光的吸收越少；反之，透光率越小，溶液对光的吸收越多。第十五页，共四十五页，2022年，8月28日

透光率的负对数称为吸光度，用A表示。A越大，溶液对光的吸收越多。

第十六页，共四十五页，2022年，8月28日（二）Lambert-Beer定律

溶液对光的吸收除与溶液的本性有关外，还与入射光波长、溶液浓度、液层厚度和溶液温度等因素有关，它们之间的关系符合以下数学公式：A=kbc当一束平行的单色光通过均匀的某溶液时，溶液的吸光度与溶液的组成标度和液层厚度的乘积成正比，这一定律称为Lambert-Beer定律，又称为光吸收定律。第十七页，共四十五页，2022年，8月28日注意：

使用Lambert-Beer定律有两个限制条件：单色光和稀溶液。第十八页，共四十五页，2022年，8月28日

1.摩尔吸光系数

b：液层厚度（cm）

c：溶液物质的量浓度（mol·L-1）

ε：摩尔吸光系数（L·mol-1·cm-1）

第十九页，共四十五页，2022年，8月28日

若用质量浓度ρ(g·L-1)代替物质的量浓度c，则上述公式可表示为：

a：质量吸光系数（L·g-1·cm-1）2.质量吸光系数第二十页，共四十五页，2022年，8月28日

a和ε可通过下式转换：

M表示被测物质的摩尔质量

ε或a的数值越大，表明溶液对入射光越容易吸收，测定的灵敏度就越高。一般ε值大于103即可进行分光光度法测定。

第二十一页，共四十五页，2022年，8月28日由Lambert-Beer定律可知：第二十二页，共四十五页，2022年，8月28日

P96【例10-1】某化合物的相对分子质量为251，用乙醇溶剂配成浓度为0.150mmol·L－1的溶液，在480nm波长处用2.00cm吸收池测得透光率为39.8％，求该化合物的ε和a

。第二十三页，共四十五页，2022年，8月28日解：由Lambert-Beer定律可得第二十四页，共四十五页，2022年，8月28日例：M＝250（g·mol-1）的某物质，ε（λmax）5.0×104L·mol-1·cm-1，若将原溶液稀释10倍，于1.00cm吸收池中测得A＝0.40，问原溶液的质量浓度（mg·L-1）为多少？第二十五页，共四十五页，2022年，8月28日解第二十六页，共四十五页，2022年，8月28日

三、单色光的选择

入射单色光的波长，可通过制作吸收光谱选择：将不同波长的单色光依次通过某一固定浓度的有色溶液，测定相应的吸光度A，以波长λ为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，可得一曲线，此曲线就是吸收光谱或吸收曲线。第二十七页，共四十五页，2022年，8月28日以KMnO4溶液的吸收光谱图为例，看看它的吸收光谱：

KMnO4溶液的吸收光谱λmax=525nm，说明溶液最容易吸收波长为525nm附近的光，因此，它的入射单色光的波长选定为525nm。第二十八页，共四十五页，2022年，8月28日溶液对不同波长的光吸收程度是不同的，最大吸光度对应的波长称为最大吸收波长，用λmax

表示。λmax表示溶液对该波长的光最容易吸收，吸收程度最大，在此波长下测定吸光度，灵敏度最高，此λmax

也就是所要选择的入射单色光的波长。

第二十九页，共四十五页，2022年，8月28日第二节比色分析的方法和仪器一、分光光度计二、测定方法第三十页，共四十五页，2022年，8月28日

可见分光光度法是以可见光作光源，经单色器分光后，以所需波长的单色光作入射光，通过测定溶液的吸光度来计算溶液中被测物质含量的一种分析方法，所用的仪器称为分光光度计。第三十一页，共四十五页，2022年，8月28日

一、分光光度计

光源单色器

吸收池检测器信号处理及显示器第三十二页，共四十五页，2022年，8月28日

1、光源可见分光光度计是以钨灯作光源。钨灯可发出320至3200nm的连续光谱，波长最适宜的波长范围为360至1000nm。2、单色光器单色光器由棱镜或光栅、狭缝和准直镜等部分组成。通过转动棱镜便可在出光狭缝得到所需波长的单色光。第三十三页，共四十五页，2022年，8月28日所以混合光从空气进入棱镜后，便按波长由长到短的顺序依次分散成为一个连续光源。单色光器的作用就是将混合光分散成一系列的单色光。白光在棱镜中的色散第三十四页，共四十五页，2022年，8月28日

3、吸收池分光光度计中用来盛放溶液的容器称为吸收池又称为比色皿，是用光学玻璃制成。在测定中同时配套使用的吸收池应相匹配，即有相同的厚度和相同的透光性。4、检测器可见分光光度计中的检测器一般用（光电池或）光电管，它是用一个阳极和一个对光敏感材料制成的阴极所组成的真空二级管，当光照射到阴极时，表面金属发射电子，流向电势较高的阳极而产生电流。第三十五页，共四十五页，2022年，8月28日

5、显示器光电管输出的电讯号很弱，约为1×10－6A，经放大器放大后输入显示器。显示器一般有微安电表，记录器，数字显示和打印等。透光率刻度是等分的，因吸光度与透光率是负对数关系，所以吸光度刻度是不均等的。吸光度和透光率标尺第三十六页，共四十五页，2022年，8月28日

721型分光光度计光学系统示意图1．光源；2,8．聚光透镜；3．棱镜；4．准直镜；5,11．保护玻璃；6．狭缝；7．平面反射镜；9．吸收池；10．光门；12．光电管第三十七页，共四十五页，2022年，8月28日二、测定方法（一）标准曲线法（二）标准对照法第三十八页，共四十五页，2022年，8月28日（一）标准曲线法

测定步骤：（1）配制标准系列：用标准样品配制一系列不同浓度的标准溶液（称为标准系列）。（2）测定标准系列的吸光度A：将标准系列置于一定规格的比色皿中，在一定波长（λmax

）下，测定其相应的吸光度A值。（3）绘制标准曲线：以溶液的浓度为横坐标，相应的A值为纵坐标作图，得到一条通过坐标原点的直线——

标准曲线。第三十九页，共四十五页，2022年，8月28日（4）样品含量的测定：用相同的方法，在相同的条件下测定样品溶液的A值，然后在标准曲线上找到该A值，其对应的浓度数值即为样品溶液的浓度。00.20.40.60.811.2050100150200A维生素B12的标准曲线第四十页，共四十五页，2022年，8月28日（二）标准对照法

先配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液（其浓度用cs表示），在处测出吸光度As

，在相同条件下测出试样溶液的吸光度Ax

，则试样溶液的浓度cx

可按照下式求得：此法适用于非经常性的分析工作。第四十一页，共四十五页，2022年，8月28日第四节比色分析－铁的测定1、邻二氮菲法2、硫氰酸盐法3、磺基水杨酸法第四十二页，共四十五页，2022年，8月28日1、邻二氮菲法

Fe2+与邻二氮菲反应生成红色螯合物：

第四十三页，共四十五页，2022年，8月28日

在控制溶液的pH＝5～6时显色，其它共存离子不干扰。当Fe