培养基成分与配制

培养基成分与配制第一页，共四十一页，2022年，8月28日实质上，对于整株植物生长有重要作用的这15种元素，对于组织培养来说也是必需的。各种常用培养基之间在组分上的主要差别，即在于各种盐或离子数量上的不同。由质上来看，各种植物组织所需要的无机营养是相当一致的。当无机盐在水中溶解的时候，它们发生解离，形成离子。培养基中的活性因子即是这些离子，而不是它们的化合物。一种类型的离子可由一种以上的盐提供。

第二页，共四十一页，2022年，8月28日

White培养基是最早的植物组织培养基之一，其中包含了所有必需的营养成分，被广泛用于根的培养。不过，很多研究者的经验表明，要想使愈伤组织能令人满意地生长，这个培养基中的无机成分在数量上是不足的。早期采用的克服这种缺陷的办法是在培养基中加入某些复杂的混合物，如酵母浸出物、水解酪蛋白、椰子汁和氨基酸等。为了改进合成培养基，后来的研究者通过增加各种无机盐的浓度，特别是钾和氮的浓度，成功地取代了那些复杂的混合物。和White培养基比较，在现在广泛应用的各种培养基中，多数都含有浓度较高的无机盐。Heller（1953）在其培养基中加入了铝和镍，但这两种元素的必要性并未得到证明，因此已被后来的研究者所省略。钠、氯化物和碘化物的必要性迄今也还没有得到证明。

第三页，共四十一页，2022年，8月28日

在White（1943）原来的培养基中，铁是以Fe２(SO４)３的形式加入的，但Street及其合作者在根培养中以FeCI２代替了Fe２(SO４)３，这是因为在Fe２(SO４)３中含有Mn和某些其他金属离子杂质。然而，FeCI２看来也并不是一个完全令人满意的铁盐。以这种形式存在的铁只有在PH5.2左右时才能被组织所利用。已知在根培养中，接种后一周之内培养基的PH值即会由原来的4.9～5.0上升到5·8～6.0，于是根开始表现缺铁症状。为了解决这个问题，现在在多数培养基中铁是以一种螫合形式，即Fe·EDTA（EDTA乙二胺四乙酸）的形式提供的。以这种形式提供的铁直到PH7.6～8.0仍然可以被植物组织所利用。附带说一下，与根不同，愈伤组织培养物直到PH为6.0时仍可利用FeCI２，这是因为愈伤组织能分泌自然的鳌合剂，而螫合剂可与铁相结合。FeEDTA可使用FeSO４·7H2O对和Na2·EDTA进行制备，或者，如果可能的话，从市场上直接购买NaFe·EDTA。

第四页，共四十一页，2022年，8月28日在培养基中无机氮的供应可以有两种形式，一种是硝酸盐；另一种是铵盐。当做为唯一的氮源时，硝酸盐的作用要比铵盐好得多，但在单独使用硝酸盐时，培养基的PH会向碱性方向漂移。若与硝酸盐一起加入少量铵盐，则会阻止这种漂移。因此，有好几种培养基都既含有硝酸盐，也含有铵盐。

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当某些营养元素的供应不足时，愈伤组织所表现出来的症状如下：氮——某些组织（五叶地锦）表现出一种很引人注目的花色素苷的颜色；不能形成导管；氮、钾或磷——细胞过度生长，形成层组织减退；硫——非常明显地褪绿；铁——细胞分裂停止；硼——细胞分裂停滞，细胞伸长；锰或钼——影响细胞伸长。第六页，共四十一页，2022年，8月28日2.有机营养成分(1)含氮物质

大多数培养的细胞都能合成所有必需的维生素，只是数量上显然不足。为了能使组织很好地生长，在培养基中常常必须补加一种或一种以上的维生素和氨基酸。其中硫胺素（维生素B１）一般认为是一种必需的成分。在其他各种维生素中，已知尤其是吡哆醇（维生素B6），烟酸（维生素B３），泛酸钙（维生素B５）和肌醇也都能改善培养的植物组织的生长状况。各种维生素皆溶于水，唯叶酸例外，先要用少量稀氨水溶解，然后加蒸馏水定容。

第七页，共四十一页，2022年，8月28日为了促进某些愈伤组织和器官的生长，还常使用很多种化学成分不明的复杂的营养混合物，如水解酪蛋白（CH），椰子汁（CM），玉米胚乳，麦芽浸出物（ME），番茄汁（TJ）和酵母浸出物（YE）等。不过，只要可能，应尽量避免使用这些天然物质。这些物质（特别是果实提取物）在样品间的差异将会影响实验结果的可重复性。这是因为，这类提取物所含的生长促进成分的质和量常因组织的年龄和供体植株的品种而变化。此外，只用一种氨基酸也可能有效地取代这些天然物质。第八页，共四十一页，2022年，8月28日(2)碳源

Haberlandt（1902）曾试图培养绿色的叶肉细胞，这可能是出自绿色细胞对营养的要求比较简单的想法，但这种想法在实验中并未得到证实。现在我们知道，作为一个规律，起初是绿色的组织在培养中会逐渐失去它们的叶绿素，而只依赖于外界碳源生活。即使是那些在培养期间由于某些突然变化或被置于特殊条件之下而获得了色素的组织，也不是碳素自养的。如果在培养基中加入一种合适的碳源，就是在培养中已经充分分化了的绿色幼茎也会生长得更好。由此看来，在培养基中加入一种可被利用的碳源是十分必要的。

第九页，共四十一页，2022年，8月28日最常用的碳源是蔗糖，浓度一般为2％～5％。已知葡萄糖和果糖也能使某些组织生长得很好，Ball（1953，1955）证实，对于红杉属植物（Sequoia）愈伤组织的生长来说，经过高压灭菌的蔗糖优于过滤灭菌的蔗糖，看来高压灭菌能使蔗糖水解成为更能被有效利用的糖，如果糖。一般来说，以蔗糖做碳源时，离体的双子叶植物的根生长得最好。而以右旋糖（葡萄糖）做碳源时，单子叶植物的根生长得最好。矮生苹果（Mainspumila，品种Mclntosh）的组织培养物在以山梨醇做碳源和以蔗糖或葡萄糖做碳源时都长得很好。已知植物能够利用的某些其他形式的碳源有麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖。红杉属植物和玉米胚乳的组织培养物甚至可以代谢作为唯一碳源的淀粉。

第十页，共四十一页，2022年，8月28日3.植物生长物质

除了营养物质以外，为了促进组织和器官的生长，通常还有必要在培养基中加入一种或一种以上的生长调节物质。如生长素、细胞分裂素或赤霉素。第十一页，共四十一页，2022年，8月28日(1)生长素

在自然界中，生长素影响到茎和节间的伸长、向性、顶端优势、叶片脱落和生根等现象。在组织培养中，生长素被用于诱导细胞的分裂和根的分化。在组织培养中常用的生长素有：IAA、IBA、NAA.、NOA（萘氧乙酸）、P－CPA（对氯苯氧乙酸）、2,4-D（二氯苯氧乙酸）和2,4,5－T（三氯苯氧乙酸）。其中IBA和NAA广泛用于生根，并能与细胞分裂素互作促进茎的增殖。2,4-D和2,4，5－T对于愈伤组织的诱导和生长非常有效。生长素一般溶于95％酒精或0.lmol／L的ＮaOH中，以后者的溶解效果更好。第十二页，共四十一页，2022年，8月28日生长素活性:2,4-D>NAA>IAA2,4-D的活性经IAA高8-12倍,2,4-D在植物体内比较稳定,而IAA极不稳定。第十三页，共四十一页，2022年，8月28日(2)细胞分裂素

细胞分裂素影响细胞分裂、顶端优势的变化和茎的分化等。在培养基中加入细胞分裂素的目的，主要是为促进细胞分裂和由愈伤组织或器官上分化不定芽。由于这类化合物有助于使腋芽由顶端优势的抑制下解放出来，因此也可用于茎的增殖。比较常用的细胞分裂素有：BAP（苄氨基瞟呤），6－BA（苄基腺瞟呤），2－iP（异戊烯氨基膘呤）和(KT)激动素（呋喃氨基嘌呤）。细胞分裂素一般溶于0.5或lmol／L的HCI或稀的NaOH中。第十四页，共四十一页，2022年，8月28日细胞分裂素的活性：ZT>BA>KT>腺嘌呤.ZT的活性比KT高10倍,KT的活性比腺嘌呤>3万倍.第十五页，共四十一页，2022年，8月28日(3)赤霉素

赤霉素有20多种，其中在组织培养中所用的是GA３。与生长素和细胞分裂素相比，赤霉素不常使用。据报道，赤霉素能刺激在培养中形成的不定胚正常发育成小植株。赤霉素易溶于冷水，每升水最多可溶解1０００mg。GA３溶于水后不稳定，容易分解，故最好以95％酒精配成母液在冰箱中保存。

第十六页，共四十一页，2022年，8月28日4.琼脂

如果使用液体培养基进行静止培养，组织将会沉没并因缺氧而死亡。为了避免这种情况，可用琼脂使培养基凝胶化，然后把组织置于培养基表面。琼脂是一种由海藻得来的多糖类物质，一般的使用浓度是0.7％～1％，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质就难于扩散到培养的组织中去。由于在这种半固体培养基上所建立的培养物便于保存，而且对于多种目的的实验来说都能得到令人满意的结果，因此琼脂固化培养基得到了广泛的应用。但琼脂并非是培养基中的一种必需成分。单细胞和细胞聚合体可以在含有无机和有机营养以及激素的液体培养基中进行悬浮培养。不过，在悬浮培养中必须定时通气，其方法或是由培养基底部鼓入无菌空气，或是不断轻轻摇动。在原生质体培养中，如果采用浅层液体培养基或小滴液体培养基进行培养，则可保持静止，不必通气。第十七页，共四十一页，2022年，8月28日

5.PH值在灭菌之前PH值一般都是调节到5.0-6.0之间，一般来说，当PH值高于6时，培养基会变硬，低于5时，琼脂不能很好地凝固。

6.其他成分

（1）活性炭：在培养基中加入活性炭（AC）主主要是为了吸附植物的有害分泌物，但活性炭对物质吸附的选择性很低，它同时也吸附某些植物必需的化合物。活性炭的用量一般为0.5%-3%。注意：在高压灭菌之前加入活性会降低培养基的PH值，合使培养基不易凝固。

第十八页，共四十一页，2022年，8月28日

（2）硝酸银：离体培养的植物组织会产生和散发乙烯，而乙烯在培养容器中和积累会影响培养物的生长和分化，AgNO3中的Ag+通过竞争性地结合于细胞膜上的乙烯受体蛋白，从而可起到抑制乙烯活性的作用。培养基中加AgNO3能促进愈伤组织器官发生或体细胞胚胎发生，并能使某些原来再生困难的物种分化出再生植株。AgNO3对于克服试管苗玻璃化及早衰和落叶等也有明显效果。由于低浓度AgNO3能引起细胞坏死，而这种坏死、细胞会产生一定数量的乙烯，所以AgNO3不一定总能阻止乙烯的积累。AgNO3的使用浓度一般为1—10mg/l。使用过滤灭菌。

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（3）抗生素：培养基中添加抗生素的主要目的，是防止由外植体内生菌造成的污染。注意：不同抗生素抑制不同菌种，因此要有针对性选择抗生素；有时必须几种抗生素结合使用才能取得较好的效果；抗生素的使用对植物的生长有一定的抑制作用；在停用抗生素后，污染率往往显著上升。常用的抗生素有青霉素、链霉素、土霉素等，用量一般为5—20mg/L。大部分要求过滤灭菌。第二十页，共四十一页，2022年，8月28日二、培养基的种类

长期以来,根据组织培养的不同目的和选用的不同材料,科学工作者们设计了许多不同种类的培养培养基基，最常见的培养基为MS培养基（见表3-1）。MS培养基：Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要,因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。

第二十一页，共四十一页，2022年，8月28日

表3-1MS培养基

大量元素(mg/L)微量元素(mg/L)（NH4NO3）…….1650KI…………….….0.83（KNO3）……….1900H3BO3………..…6.2（CaCI22H2O）….440MnSO44H2O……22.3（MgSO47H2O）...370ZnSO47H2O………8.6（KH2PO4）……..170Na2MoO42H2O….0.25维生素CuSO45H2O…….0.025肌醇……………….100CoCl26H2O……..0.025烟酸……………….0.5FeSO47H2O…….27.8盐酸硫铵素……….0.1NaEDTA………....37.3盐酸吡哆素………0.5生长调节物质有机附加物KIN…………...0.0410甘氨酸…………….2.02，4-D…………...1-30蔗糖……………….30g/LpH…5.7第二十二页，共四十一页，2022年，8月28日植物组织培养能否取得成功,营养培养基的种类是一个很关键的问题。比较常用的培养基及其成分见表3-2。第二十三页，共四十一页，2022年，8月28日表3-2常用的培养基及其成分第二十四页，共四十一页，2022年，8月28日第二十五页，共四十一页，2022年，8月28日表3-3不同培养基离子浓度的比较第二十六页，共四十一页，2022年，8月28日三、培养基的选择1.培养基选择的原则(1)目的性强：要针对不同的培养目的如初代培养、增殖培养、生根培养，分别选择最适合的培养基;(2)成本低廉：要考虑到工厂化生产时的运营成本，以总体运营效益来评价一种培养基的优劣。

(3)方便可行：试剂容易选购，培养基的制备操作简单易行。第二十七页，共四十一页，2022年，8月28日2.培养基筛选的方法

(1)选择基本培养基:

在建立一个新的实验体系时，为了能研制出一种适合的培养基，一般最好先由一种已被广泛采用的基本培养基（如MS或B５）开始。第二十八页，共四十一页，2022年，8月28日(2)选择最佳激素组合:在植物组织培养基中最常改动的因子是生长调节物质，尤其是生长素和细胞分裂素。开始时，可以选择一种基本培养基，以及不同激素组合，比如说，各有5种不同浓度（0，0.5，2.5，5，10μmol／L）的某种生长素（例如NAA）和某种细胞分裂素（例如BAP）。这两种激素5种浓度的所有可能组合，即构成了一个具有25项处理的实验（表3．4）。由这25项处理中选出最好的一个，然后在保持浓度不变的情况下，再试验其他种类的生长素和细胞分裂素。注意:当改变细胞分裂素的种类时，保持生长素不变，反之亦然。第二十九页，共四十一页，2022年，8月28日表3-4二种激素五种浓度的各种组合第三十页，共四十一页，2022年，8月28日(3)选择适宜的盐分浓度:

高浓度盐分培养基对若干实验体系来说都已证明效果很好，但有某些培养物在低浓度盐分培养基上生长得更好，因此就还有必要试验一下在保持生长调节物质最佳组合不变的情况下，1／2和1／4水平的基本培养基盐分的效果。第三十一页，共四十一页，2022年，8月28日(4)确定适宜的蔗糖浓度:

在保持其他成分不变的情况下，设计一个蔗糖浓度梯度（2％～6％以至更高），一筛选出最适宜的蔗糖浓度。通过以上这些实验，常常就足以研制出一种适合的培养基。不过，为了对这种培养基做进一步的改良还有很多其他可能性值得探讨。第三十二页，共四十一页，2022年，8月28日(5)广谱实验法:

为了能给一个新的实验体系选出一种适合的培养基，DeFos-sard等（1974）介绍了一种“广谱实验法”。和上面介绍的方法相比，这个方法是比较复杂的。然而，如果利用简单的方法解决不了问题，就有必要用这个方法试验一下。

1)在这个广谱实验法中，把培养基中的所有组分分为4大类：无机盐、生长素、细胞分裂素、有机营养物质（蔗糖、氨基酸和肌醇等）。2)对每一类物质再选定3个浓度，即低（L），中（M）和高（H）（见表3-4）。4类物质各3种浓度的各种不同组合即构成了一项包括81个处理的实验。3)在这81个处理中最好的一个可用４个字母表示。例如，一个包含中等浓度无机盐、低浓度生长素、中等浓度细胞分裂素和高浓度有机营养物质的处理即可表示为MLMH。顺序是无机盐-生长素-细胞分裂素-有机营养。4)达到这个阶段以后，即可再试验不同类型的生长素和细胞分裂素，以找到它们的最好类型。第三十三页，共四十一页，2022年，8月28日表3-5广谱实验法中，各类物质的成分和浓度第三十四页，共四十一页，2022年，8月28日四、培养基的制备1.干粉直接配制:

现在配制培养基的最简单的方法是用市售培养基干粉，其中含有无机盐、维生素和氨基酸。把这种干粉溶解在蒸馏水里（要比培养基的最终容积少10％），加上蔗糖、琼脂和其他必要的补加物，最后再加入蒸馏水使之达到最终的容积。调节PH，高压灭菌，于是制成所需要的培养基。在有些国家有厂家制作和销售这种干粉培养基，我国市场上目前尚无供应。干粉培养基可用于常规的实验目的，如植物的快速繁殖等，在这类实验中所需的培养基成分是早已完全确定了的。在这种情况下，使用干粉培养基就可以节省时间和金钱。第三十五页，共四十一页，2022年，8月28日2.储备母液配制:

(1)浓缩贮备液的浓缩倍数：

1)大量元素（浓缩20倍）；2)微量元素（浓缩200倍）；3)铁盐（浓缩200倍）；

4)除蔗糖之外的有机物质（浓缩200倍）。5)生长调节物质(浓度:mg/ml,分别配制)（2）浓缩贮备液配制方法：以培养及为例，其贮备液的配置如表3-6所示。第三十六页，共四十一页，2022年，8月28日表3-6MS贮备液的配制第三十七页，共四十一页，2022年，8月28日（3）浓缩贮备液配制时注意问题：

1)在制备这4种贮备液的时候，应使每种成分分别溶解，一粒不剩，然后再把它们彼此混合;2)各种生长调节物质的贮备液应当分别配制，如果它们是不溶于水的，则应先把它们溶解在很少量的适当溶剂中（见第3．2.3节），然后再加蒸溜水到最终容积。

3)生长调节物质浓度取决于所要求的生长调节物质的水平，其贮备液的强度可以是１mmol／L，也可以是10mmol／L。

4)所有贮备液都应贮存于适当的塑料瓶或玻璃瓶中，置冰箱中保存。铁盐贮备液须贮存于琥珀色玻璃瓶中，在贮备椰子汁（液体胚乳）的时候，要先