用于原油污染的生物技术(低版本)

应用于原油污染土壤及含油污水处理的生物技术核心生物技术烃降解菌及培养技术鼠李糖脂发酵液及产生菌工程化的技术基础及潜力原油污染的水、土壤处理烃降解菌及培养技术采油用菌A:编号为JD-1、JD-3、TJ-1和Z5的菌种属于假单胞菌属，可以降解难以降解的有机物，包括苯和萘等

B:编号为VJ-3Ⅱ、VJ-2IV和Z9的菌种属于不动杆菌属，可以降解石油烃，尤其是石油中C13~C32之间的正构烷烃

C:产气菌：以芽胞杆菌、假单胞杆菌为主的菌群；产生的气体以二氧化碳、乙烷、丙烷、异丁烷、正丁烷等

D:产酸、表活剂等菌群：以巴氏醋酸杆菌、假单胞菌、不动杆菌、红球菌等、节杆菌等的混合菌群烃降解菌及培养技术：前期的技术积累烃降解菌及培养技术：前期的菌种分析A、B两类菌属，当做油井解堵作业、微生物驱油使用时，占菌株数量的近70%，是优势菌种，有很强的石油烃降解能力，菌种与原油中的重质馏份接触48小时，重质馏份降解率可达50%以上，其它烃类的降解能力也达到35%以上。已经在前期的生物采油工程实践中，得到了验证。

以上的菌种都是在大庆油田被原油污染的井场土壤及联合站污泥中，通过定向培养（包括利用底物、代谢产物两个方向）、选择性传代筛选分离出来的，工程价值明显。通过五年多的采油业务实践，沃太斯已经完全掌握了这些菌种的筛选、保存、传代、培养、使用的技术。烃降解菌及培养技术：前期的菌种分析这些菌分类的根据，完全是在工厂工业化培养时，从营养供给的角度来分的，使用时按一定比例混合即可。从解决原油污染的角度上说，因为这些菌都可以石油烃为碳源，代谢效率很高，所以也是合适的菌群。当然各油田的原油成份不同，这些菌在使用时也要做与当地原油的配伍实验，选择不同的菌种混配方法。也可从当地筛分菌群，这样的工作，只要目的明确，在沃太斯的生物实验室完成起来很快。鼠李糖脂产生菌及鼠李糖脂表面活性剂鼠李糖脂产生菌：铜绿假单胞菌

属于革兰氏阴性杆菌。菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。在暗视野显微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼。菌体大小（1.5～5.0)um×宽(0.5～1)um。为专性需氧菌，生长温度范围25~42℃，最适生长温度为25~30℃。在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素，如绿脓素（pyocynin）与带荧光的水溶性荧光素（pyoverdin）等

沃太斯的铜绿假单胞菌是2006年从中科院引进的菌种，这株菌种相关科学家在德国进行了长达7年的以产鼠李糖脂为目标的定向代谢传代工作，在合适的发酵培养条件下，以植物油为碳源时，产脂可达25g/l。沃太斯引进十年来，进行了大量的不同碳源、以产鼠李糖脂为代谢目标的诱导传代工作，除植物油外，目前已经筛分出了以乙醇、柴油、原油、厨余油（动、植物油脂混合废油）、萄萄糖加淀粉溶液等为碳源的不同的菌种系列。尤其是以原油、厨余油为碳源的菌株，产鼠李糖脂也达到20g/l的水平。鼠李糖脂产生菌及鼠李糖脂表面活性剂鼠李糖脂产生菌及鼠李糖脂表面活性剂已经完成的以提高鼠李糖脂产率为目标的铜绿假单胞菌的传代及发酵工作，反过来也表明，这些菌种可以很高效的利用这些物质，这为这些菌种可以做为环境治理的高效微生物打下了基础。比如原油污染的水体、原油污染的土壤的处理，比如生活垃圾的处理、生活污水中油污的处理、屠宰场污水的处理等。已经发表的大量文章，也表明了产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌在这方面有巨大的应用潜力。

乙醇、柴油、原油、厨余油（动、植物油脂混合废油）、萄萄糖加淀粉溶液铜绿假单胞菌鼠李糖脂营养/底物生产菌/降解菌产物作为营养物利用作为底物被降解促进利用/降解过程鼠李糖脂产生菌及鼠李糖脂表面活性剂

鼠李糖脂在土壤、水体和植物中都自然存在，是一种糖脂类的阴离子生物表面活性剂。R1R2R3R4鼠李糖脂产生菌及鼠李糖脂表面活性剂1、鼠李糖脂的分子量通常在476~766g/mol之间，2、临界胶束浓度在20~200mg/l.3、鼠李糖脂的HLB值还没相关报道，按通常的计算方法，通过对官能影响的分析计算，它的LHB值在10~15之间。4、能使水的表面张力从72mN/m降低到30mN/m，油水界面张力从43mN/m降到1mN/m。5、耐温性:在90℃的高温下仍可保持其表面活性。6、耐盐性:10%的盐溶液中仍不沉降或析出，而化学合成表面活性剂在2-3%的盐溶液中就会失活。7、可生化降解性:在水体或土壤生物环境中都易于降解。

8、低毒或无毒，对环境友好。烃降解菌与铜绿假单胞菌协同作用

1、实验证明，铜绿假单胞菌和氮单胞菌（降解原油的优势菌）之间存在相互促进生长的作用。这表现在处理原油污染的污水时，加入鼠李糖脂发酵液（含铜绿假单胞菌）后的前三天，TCOD的值下降的很快。这是因为在烃降解菌为优势菌的原油降解体系中接入铜绿假单胞菌能够快速利用石油烃中的烷烃类化合物并合成鼠李糖脂类生物表面活性剂，从而有效提高总石油烃的降解率。2、在烃降解菌为优势菌的原油降解体系中加入铜绿假单胞菌虽然使饱和烃的降解率大大提高，短期内却降低了芳烃的降解率；这说明铜绿假单胞菌和其它烃降解菌之间可能存在竞争生长关系。但这种情况维持时间会很短，体系中的铜绿假单胞菌以原油为营养物代谢的鼠李糖脂表面活性剂聚集到一定程度（一个CMC浓度以上时），芳烃的降解率因为表面活性剂的存在，重新增加。鼠李糖脂与烃降解菌的协同作用

鼠李糖脂能促进石油烃降解菌的生长，说明鼠李糖脂对烃降解菌无毒性。

由下图,不同浓度下鼠李糖脂均未明显改变烃降解菌的生长情况鼠李糖脂与烃降解菌的协同作用

研究表明，添加鼠李糖脂后，石油烃的降解效率提高了11~26%，同时烃降解菌降解石油烃的半衰期缩短了近1倍。鼠李糖脂与烃降解菌的协同作用

鼠李糖脂对菌株表面的影响：如图(a)所示,未加入鼠李糖脂的菌细胞表面比较光滑,菌种之间独立生长,而加入鼠李糖脂后培养的菌种细胞表面略显粗糙,如图(b)所示,菌种之间粘连在一起,有助于细胞与疏水性有机物的接触。表明鼠李糖脂能引起细胞表面亲水性多糖类脂物质的流失,取而代之的是疏水性较强的磷脂类物质,细胞表面疏水性增大,菌细胞与烃类化合物之间的结合力增强。可见,加入鼠李糖脂可以改变微生物表面的形态和性质,使细胞与疏水性有机物的结合力增强,这有利于提高降解速率。

鼠李糖脂与烃降解菌的协同作用

鼠李糖脂对石油烃有吸附作用,增加了石油烃溶解性,更多的进入水相,增强微生物的降解性。培养时间为7d,温度为35℃,鼠李糖脂浓度为60mgPL。3个因素的最佳组合下,在接种量为5%时,降解率为82%,降解效果好。鼠李糖脂与烃降解菌的协同作用

以上讨论的协同作用的机理，更多的表现为在油水两个液相之间。但这些原理在固液两相表面上应用时，要把污染物质从固相表面剥离，实现污染物质转移到液相，这个过程一般要靠表面活性剂来完成。从污染处理的角度，这个或这些表面活性剂的选择，有两个原则：一是要能快速实现，二是不增加新的污染物质。大量的科学实验表明，鼠李糖脂是很好的选择。鼠李糖脂与烃降解菌的协同作用

鼠李糖脂具有乳化、增溶作用,能显著增加石油烃在水中的溶解度,增强有机污染土壤的洗脱效果，有利于微生物和石油烃之间的接触。机理如下:第一,生物表面活性剂减小了液、固相之间的表面张力,因此可以将阻塞在土壤孔隙中的油类物质分散并通过溶液本身将其洗脱出来;第二,低浓度的生物表面活性剂能显著降低两相的界面张力,使有机物得以扩散。同时,两相界面面积增大,便于细胞和油滴之间直接接触;第三,当生物表面活性剂浓度大于临界胶束浓度(CMC)时,便形成了胶团,同时将有机物分子加溶在此胶团中,胶束的内部具有憎水性,而外部则具有亲水性。难溶有机物的憎水性使得其很容易分配到胶核内核,从而使其在表面活性剂溶液中的溶解度大大提高,因而能更好地从土壤中被洗脱出来;第四,生物表面活性剂利用亲水基团固定在微生物细胞的表面,而另一端则暴露在外,从而可以控制细胞表面的疏水性或亲水性。微生物可以分泌生物表面活性剂于外部介质,改变吸附界面的特性来调节细胞与界面的亲和力,从而增强土壤中有机污染物的洗脱效果。鼠李糖脂（发酵液）及产生菌工程化应用于原油污染处理的另外一些技术基础一、以提高油水乳化效果及稳定性的表面活性剂复配技术在满足特定的油水乳化效果及稳定性的需要时,一般通过与其他表面活性剂进行复配来提高体系的界面活性,增大体系的乳化能力。研究人员考察了与SDSSDBSAEO3等常用的表面活性剂的复配：1、由于RL分子空间位阻的差异,R1与SDS复配体系增效明显而R2与离子型表面活性剂SDS(十二烷基硫酸钠)复配体系无协同作用.2、两者与SDBS复配时,体系都出现了好的协同效果,因此采油工程中，经常用RL与石油磺酸盐复配，以提高油田乳化的稳定性。3、由于RL与非离子型表面活性剂AEO3（脂肪醇聚氧乙烯醚）头基亲水性相差较小,RL与AEO3复配后两种表面活性剂的吸附空间位置相近,产生竞争吸附,RL将AEO3由界面挤到液体相中,离开界面，两者间没有协同作用.一、以提高油水乳化效果及稳定性的表面活性剂复配技术鼠李糖脂（发酵液）及产生菌工程化应用于原油污染处理的另外一些技术基础4、实验表明：鼠李糖脂与OP系列表面活性剂有良好的复配性能。OP10和OP4重量比约为30%∶70%左右的复合表活剂,及OP7和OP4重量比约为50%∶50%左右的复合表活剂,与大庆原油均较匹配,油水界面张力值较低。

通过上面的实验，一般认为由于鼠李糖脂为弱阴离子表面活性剂，所以在与其它表面活性剂复配时，选择非离子表面活性剂或阴离子表面活性剂。这个技术经常被用来在进行被原油污染的土壤淋洗时，对表面活性剂的选择。鼠李糖脂（发酵液）及产生菌工程化应用于原油污染处理的另外一些技术基础二、以提高油水乳化状态稳定性为目的添加剂1、碱（包括强碱、弱碱）：通常有下面几个作用，一是与原油中的酸反应，生成皂类，起到助表面活性剂的作用；二是与污水中的钙、钡等离子反应，减少这些两价阳离子在油水界面的浓度，使得油水界面双电层得到压缩，油水界面更稳定。三是与土壤颗粒中的多价阳离子反应，用小的金属离子（如钠、钾）把多价阳离子置换出来，改变土壤颗粒结构，增大油水接触比表面积；2、与1的作用机理相近的强碱弱酸盐，如海藻酸钠、腐植酸钾等。3、醇类：一）如果添加大量的低分子醇类，这些低分子醇先与原油相溶，使得原油的分散能力更好，形成乳化的机会增加；二）是脂肪醇对表面活性剂的溶液，能显著降低其临界胶团浓度、表面张力，提高起泡性、乳化性等表面活性，并且这种作用随脂肪醇的浓度增加和醇的烃链的加长而变得越显著；三）、多元醇，如环己六醇、山梨醇、木糖、果糖等，它们能使表面活性剂的cmc下降。4、无机盐：常用的是氯化钠。对于离子型表面活性剂，在溶液中加入无机盐时，溶液表面活性提高，cmc下降。盐能显著促进离子型表面活性剂的缔合，使其胶团聚集数增大；也能使非离子表面活性剂在水中的溶解度增加。鼠李糖脂（发酵液）及产生菌工程化应用于原油污染处理的另外一些技术基础鼠李糖脂（发酵液）及产生菌工程化应用于原油污染处理的另外一些技术基础三、提高表面活性剂应用效率的牺牲剂土壤颗粒对表面活性剂有很强的吸附能力，所以在淋洗法处理原油污染的表面活性剂体系中，要选用价格低廉的表面活性剂或者其它水溶性极性材料来代替主表面活性剂在土壤颗粒表面吸附。常用的有：木质素及其改性产品（如木质素磺酸盐）､石油羧酸盐等。

鼠李糖脂（发酵液）及产生菌工程化应用于原油污染处理的另外一些技术基础四、pH值对鼠李糖脂表面活性的影响

鼠李糖脂是一种弱阴离子表面活性剂,在酸性条件下,比普通的羧酸型阴离子化学表面活性剂要稳定,不容易形成难溶的自由酸而降低表面活性,pH降低能促进其活性成分与H+结合,增强了溶液的表面活性。

鼠李糖脂（发酵液）及产生菌工程化应用于原油污染处理的另外一些技术基础五、以提高烃降解菌及鼠李糖脂产生菌降解效率的添加剂1、均衡的营养物质一个典型的烃降解菌在培养阶段的无机盐培养基配方：NaCl：22.0g，MgSO4·7H2O：2.0g，NH4NO3：1.0g，KCl：0.5g，KH2PO4：1.0g，Na2HP04：3.0g，CaCl2：0.1g，FeCl3：0.005g，MnSO4：0.002g，ZnCl2:0.002g这说明烃降解菌在高效工作时，除了从石油中获取碳原外，还需要其它的元素，以保证增殖及代谢的需要。在液相环境下，这些营养物质可以水溶性化学剂的方式加入；在土壤环境中，这些物质往往以有机肥、农业废弃物的方式添加。鼠李糖脂（发酵液）及产生菌工程化应用于原油污染处理的另外一些技术基础2、合适的PH值环境大部分的烃降解微生物在好氧或兼性好氧的生化过程中，中间产物都为羧酸、氨基酸，所以生化环境的PH值会降低，直到生成酸的速率与酸被利用或生化成二氧化碳的速率相当，PH值会在一个相对稳定的值上持续。实验证明烃降解混合菌最适宜的PH环境为4~9，所以为了保证生化环境的PH值，一般会用共扼酸或共扼碱来做缓冲剂，常用的为磷酸盐（磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠）。鼠李糖脂（发酵液）及产生菌工程化应用于原油污染处理的另外一些技术基础3、生化体系中氧含量一般来说，烃降解菌分为厌氧（兼性厌氧）和好氧（兼性好氧）两类。大部分在污染处理领域被使用的烃降解菌为和好氧（兼性好氧）。在含油污水处理中，常用曝气的方法来提供氧；在含油土壤处理中，常用定期翻堆或风机通气的办法提供氧。研究证实，选择200mgPL的H2O2以也可供氧,在培养过程中H2O2

很容易分解出氧气,可不断地提供氧气。因此,为加快石油烃的降解速率,更有效的降解石油烃,在添加鼠李糖脂提高微生物降解石油烃效果的同时,采用H2O2供氧,使鼠李糖脂与深度氧化协同作用以进一步提高微生物对石油烃的降解率。鼠李糖脂（发酵液）及产生菌工程化应用于原油污染处理的另外一些技术基础4、在多环芳烃污染的土壤进行清洗时，在表面活性剂体系中加入生物柴油可以起动强化清洗的作用生物柴油对表面活性剂清洗效率的提高，与生物柴油分子和胶束内表面活性剂分子的相互作用有关。生物柴油具有一定的表面活性，其分子可以插入胶束内表面活性剂分子之间，从而提高胶束对

PAHs的增溶能力，进而增加

PAHs在水相中的分配能力。此外，插入胶束内表面活性剂分子之间的生物柴油可以更好地与土壤接触，提高生物柴油对土壤

PAHs的溶解能力，从而有利于

PAHs从土壤颗粒上解吸进入胶束中。

在RH/SDBS+生物柴油的混合体系对高浓度多环芳烃污染土壤进行清洗修复，可以实现

75%的多环芳烃去除。工程化应用的潜力

一、中海石油(中国)有限公司湛江分公司涠洲终端处理厂两个5万m3原油储罐(TA-30A/B)为外浮顶储罐,设计规格为Φ60m×19.3m。该罐自1999年投产以来,至2006年3月,已连续运行8年。罐壁周围日积月累附着一些凝固的原油,导致浮船不能降到设计的最低位置1.8m。只能降到2.16m处,还有0.36m的原油(大约1000m3)不能排出外输,对原油外输油量构成了影响。采用与原油成份相近的油进行洗清。效果：用机械清洗设备完成对油罐的清洗后,除了极少量的清洗液喷射死角外,油罐的整个表面都会暴露出来,只有铁锈、砂或泥和少量积水、油残留在油罐底部。整个清洗工程仅用5天就得以完成。如果采用生物柴油+鼠李糖脂+石油磺酸盐的体系，也会有同样的效果。工程化应用的潜力工程化应用的潜力二、气浮法处理含油废水时添加鼠李糖脂减少污水中的油含量气浮法对含油废水处理是一个非常好的技术，具有除油效率高、操作时间短，设备占地面积小等优点，被广泛的应用在废水处理过程中。添加鼠李糖脂表面活性剂后会增强气泡的稳定性，降低气泡的上升速度，阻碍气泡的融和兼并，气泡的尺寸减小污染物更容易附着在气泡上，污染物的去除率进而增大。室内研究证明，鼠李糖脂的质量浓度为0.5%wt，pH为7，气浮时间为10min，

COD的去除率可达90.39%．工程化应用的潜力工程化应用的潜力三、原油污染的土壤的处理1、原位法修复

1)、实验人员从胜利油田采油井附近污染土壤中筛选获得２株细菌，其中菌株BCE为铜绿假单胞菌，能分泌表面活性剂鼠李糖脂，使石油均匀分散到水相中；菌株BCI为蜡样芽孢杆菌，具有高效的石油降解性能。两株菌复合使用，能显著增加石油与菌株的接触面，提高石油降解率。

采用草炭和麸皮固态培养菌种,当培养温度36℃、接种量10

％、料水比1:1、草炭与麸皮的质量比为1:3

、培养时间3d时，BCE密度最大，达到2.47×1011／ｇ；当培养温度32℃、接种量10％、料水比1:1、草炭与麸皮的质量比为2:12、培养时间2.5ｄ时，BCI密度最大，达到3.6×1010个／ｇ。在石油降解中，要使土壤中有效细菌数量达到个108／ｇ，可将２种菌剂分别稀释100倍和10倍后混合使用。在石油污染土壤中添加菌剂为10％时，修复１个月，石油降解率达到45％。工程化应用的潜力2)、研究人员还评价了菇渣和鼠李糖脂联合强化苜蓿修复多环芳烃(PAHs)污染土壤的效果.

结果表明，60d内，苜蓿单独修复(AL)的降解率仅为14.43%，菇渣、鼠李糖脂联合苜蓿修复(GZ+RH0.5+AL和GZ+RH1.0+AL)显著提高了PAHs降解率，达到了32.64%和36.95%，比AL处理提高了115.45%和156.06%.与AL相比，GZ+RH1.0+AL对植物生物量提高程度最大，GZ+RH1.0+AL显著提高了土壤细菌和真菌的数量，达到了5.86×106CFU·g－

1

，特别是多环芳烃降解菌数量达到了39.57×105MPN·g－

1

，分别是对照(CK)和植物单独处理(AL)的29倍和4倍.与对照(CK)相比，菇渣、鼠李糖脂和苜蓿的联合作用(GZ+RH1.0+AL)显著提高了土壤微生物群落的功能多样性.工程化应用的潜力工程化应用的潜力2、堆制法处理原油污染土壤研究人员从大庆、辽河油田污染土壤和油泥中,筛选石油高效降解的菌株和产生生物表面活性剂的菌株,对辽河油田的稀油、高凝油、特稠油和稠油不同类型的石油污染土壤，配制石油污染土壤生物修复菌剂和发酵生产的生物表面活性剂,投加于石油污染土壤生物修复中，取得了很好的效果。

固体菌剂原料采用麦麸、稻糠(市售饲料),玉米面(市售)；肥料、培养基按常规。生物预制床处理场：在辽河油田曙光采油厂附近,其规模为长20m,宽10m,周围有1m高的挡板,下设通风道和防渗层,上设防雨棚。工程化应用的潜力

运行期间环境参数变化范围气温：

12℃～