微生物遗传变异与育种-工业微生物菌种的筛选

微生物遗传变异与育种

——工业微生物菌种的筛选一、前言理想工业发酵菌种具有的特征：1.纯种培养物；2.遗传性状稳定；3.生长速度快；4.能利用廉价、来源广、成分简单的培养基；5.能忍耐不良环境因素如温度、pH、离子强度、剪切力等；6.快速生产目的产物，不产或少产毒性物质或副产物；二、微生物菌种获得的途径微生物的自然分布土壤空气水动植物体各种极端环境三、工业微生物的筛选（一）微生物样品的采集根据筛选的目的、微生物的分布情况、菌种的主要特征及其生态环境等因素，确定具体的时间、环境和目标物。土壤采样(1)采样对象—土壤细菌和放线菌

一般园田土和耕作过的沼泽土酵母和霉菌

富含碳水化合物的土壤和沼泽地中,如一些野果生长区和果园内采样的对象也可以是植物、腐败物品、某些水域等。土壤采样(2)采样方式选点—在选好适当地点，用小铲子除去5cm表土取土—取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中扎好。标记—记录采样时间、地点、环境条件等，分离—将样品逐步分批寄回，及时分离。土壤采样影响因素（1）土层的纵剖面：

最好的土层是5~25cm（2）土壤的pH：

偏碱土壤（pH7.0~7.5），细菌、放线菌；

偏酸土壤（pH7.0以下），霉菌、酵母菌；（3）土壤有机质含量和通气状况（4）表面的植被（5）地理条件（6）季节条件（二）富集培养定义：一类使混合微生物群体中某特定微生物比例激增的培养方法。目的：提高分离效率控制因素：碳源、氮源、pH、温度、需氧量控制培养基的营养成分控制培养条件添加抑制剂1.控制培养基的营养成分营养成分：碳源、氮源、无机盐类、生长因子等。成分用量K2HPO41gMgSO4∙7H2O0.2gFeSO4∙7H2O0.05gCaCl20.02g微量元素溶液0.1ml蒸馏水1L表1:基础培养及成分1.控制培养基的营养成分控制增值培养基中营养成分,特别适合分离水解酶类(纤维素酶、淀粉酶类等)的生产菌，可在富集培养基中以相应底物作为唯一碳源，加入含菌样品，并给目的微生物以最佳的培养条件培养，能利用该底物的菌类得以繁殖，而其他微生物则因得不到碳源而无法生长。但是许多的碳源、氮源可被多种多种微生物利用，不适于用作控制条件。2.控制培养条件（1）pH：一般通过添加磷酸盐缓冲液体系、碳酸钙，必要时加酸、碱方式进行调节；（2）培养温度和热处理：耐高温菌株，50~60℃温度培养；如细菌芽孢；（3）通风：一般筛选的微生物都是好氧菌，有时也分离厌氧菌，对于严格厌氧菌，除了配置特殊的培养基外，还需要厌氧培养箱、厌氧罐等设备。3.添加抑制剂被分离的微生物添加物质及其质量浓度/(mg∙mL-1)被抑制的微生物放线菌放线菌酮（50），抑霉菌素（50），环己亚胺（50），匹马霉素（50），丙酸钠（4）霉菌环己亚胺+多粘菌素+枯草菌素，多粘菌素B（50）+青霉素（1）细菌放线菌酮（50~500），制霉菌素（100），曲骨霉菌素（500）霉菌、酵母菌原虫霉素（5）原生动物革兰氏阳性菌多粘菌素B（5）革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌青霉素（1），月桂酸钠（2）革兰氏阳性菌酵母菌氯霉素（100），青霉素（20）+链霉素（40），玫瑰红（50）+放线菌酮（10）细菌放线菌酮霉菌霉菌氯霉素（100），青霉素（20）+链霉素（40），玫瑰红（35~67）细菌细菌、酵母菌（三）分离纯化为了获得某一特定的微生物菌种，必须进行微生物的分离纯化，把最需要的菌株直接从样品中分离出来；（1）常规的分离方法获得的菌落均匀，获得纯种的概率大，特别适合分离具有蔓延性的微生物操作简单，方便快捷稀释涂布法划线分离法

将待测样品适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到培养基上，经过繁殖每个单细菌长成肉眼可见的菌落，即一个菌落代表样品中的一个单细胞。根据菌落数，稀释倍数，接种量可推算出原样品中的含菌数。稀释涂布分离法一般用菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）来表示原样品中的细胞数。划线分离法b.连续划线分离法

a.分区划线分离法

2023/1/3118固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。利用某种营养缺陷型微生物作为工具菌，若待筛选菌具有将前体物转化成营养物的能力，工具菌就能围绕该菌生长。待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色圈。（2）平皿反应快速检出法菌种分离筛选流程确定采样环境

采样

设计实验方案充分查阅资料增殖培养

确定增殖条件纯种分离

划线、稀释与组织分离

菌种筛选

纯种鉴定、生产能力考查毒性试验其他鉴定微生物遗传变异与育种

——微生物遗传学现代发酵技术主要内容遗传变异的物质基础微生物的染色体分子结构微生物基因组染色体外遗传成分一、遗传变异的物质基础Q：蛋白质还是核酸？（一）经典转化实验（二）噬菌体感染实验（三）植物病毒的重建实验

经典转化实验

研究对象：肺炎链球菌结论：DNA是遗传物质分别加入到培养R型细菌的培养基中只得到R型既有R型,也有S型DNADNA+DNA酶蛋白质RNA多糖只得到R型只得到R型只得到R型R型S型噬菌体感染实验研究对象：大肠杆菌T2

噬菌体结论：DNA是遗传物质植物病毒的重建实验研究对象：TMV结论：RNA是遗传物质大多数生物DNA某些RNA一、遗传变异的物质基础核酸

绝大多数生物的遗传物质是DNA，所以说核酸是主要的遗传物质；DNA主要存在于细胞核内的染色体上，所以说染色体是遗传物质的主要载体。二、微生物的染色体分子结构染色体概述染色体（Chromosome）是细胞内具有遗传性质的物体，易被碱性染料染成深色，所以叫染色体。其本质是脱氧核甘酸，是细胞核内由核蛋白组成、能用碱性染料染色、有结构的线状体，是遗传物质基因的载体。细胞核染色体棒状可染色结构生命的基本单位。细胞有丝分裂时可见（一）原核微生物拟核体与真核生物相比，原核微生物的染色体要简单的多，其染色体通常只有一个核酸分子（DNA或RNA），其遗传信息的含量也比真核生物少的多；病毒染色体只含有一个DNA或者RNA分子，可以是单链也可以是双链，大多呈环状，少数呈线性分子；细菌染色体均为环状的DNA分子；原核微生物染色体原核细胞拟核体染色体一条闭环双链分子原核生物染色体：并不是“裸露”的DNA分子，其DNA分子同样与蛋白质和RNA等其他分子结合。如：大肠杆菌DNA与集中DNA结合蛋白相结合，此外，还结合有RNA。（二）真核微生物染色体1.染色质：

染色质是染色体在细胞分裂的间期所表现的形态，是DNA和蛋白质以及少量的RNA组成的复合物，蛋白质包括组蛋白和非组蛋白两类；2.核小体：

染色质的基本结构单位是核小体，由DNA和组蛋白组成；32

DNA在组蛋白核心外盘绕1.75圈，共146个bp，平均每个核小体的重复单位约为200bp。组蛋白H1在核小体外面，结合于连接DNA上，使核小体能彼此相连形成念珠状结构核小体中组蛋白和DNA的比例左手螺旋332nmDNA压缩比为6核小体的形成是染色体DNA压缩的第一阶段离子强度低、无H1200bp

DNA10nm核小体长度缩短7倍离子强度较高且有H1核小体链30nm螺线管(每圈6个核小体)染色体压缩比：7×6×40×5＝8400染色质的第二级组织150nm突环(～75000bp)形成超螺旋300nm玫瑰花结(6个突环)700nm螺旋圈(30个玫瑰花结)超螺旋圆筒压缩比为40压缩5倍形成染色单体1400nm染色体(每个染色单体含10个螺旋圈)（二）真核微生物染色体3.染色体的结构模型染色体

两条染色单体

每条染色单体

染色质+染色粒（二）真核微生物染色体4.着丝粒和端体（1）着丝粒：（2）端体：

防止染色体末端被DNA酶酶切防止染色体末端与其他DNA分子结合使染色体末端在DNA复制过程中保持完整三、微生物基因组（一）概念1.基因组的概念：DNA是巨大的生物高分子，一般将细胞内遗传信息的携带者在染色体所包含的DNA总体称为基因组。2.细菌在一般情况下是一套基因，即单倍体；真核微生物通常有两套基因，又称二倍体；3.基因组通常是指全部的一套基因；（二）原核微生物基因组的概念1.基因组较小，没有核膜包裹，且形式多样；2.具有操纵子结构；3.DNA分子绝大部分用于编码蛋白质，不编码的部分通常包含控制基因表达的顺