wang 2.2动物细胞工程

动物细胞培养和核移植技术专题2动物细胞工程动物细胞培养动物细胞融合生产单克隆抗体动物细胞核移植动物细胞工程常用技术其中动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础动物细胞培养和核移植技术一、动物细胞培养过程阅读“动物细胞培养过程”并思考：

1、动物细胞培养的概念是什么？该技术实施的原理是什么？有什么特点？

2、为什么要对取出的动物组织进行处理，使细胞分散？

3、用胰蛋白酶对动物组织进行处理是因为细胞间的物质主要是什么？用胃蛋白酶可以吗？

4、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？

5、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？

6、简述动物细胞培养的操作过程动物细胞培养概念：

动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖。原理

细胞增殖（有丝分裂）

动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液制成细胞悬浮液10代细胞部分细胞“癌变”，无限传代动物细胞培养不能最终培养成动物体50代细胞原代培养传代培养细胞贴壁剥离、分瓶细胞株细胞细胞系2.动物细胞培养过程：增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养去掉组织间蛋白2、为什么要对取出的动物组织进行处理，使细胞分散？

分散的单个细胞①容易摄取所需的营养，②容易排出代谢废物；一、动物细胞培养过程3、用胰蛋白酶对动物组织进行处理是因为细胞间的物质主要是什么？用胃蛋白酶可以吗？

细胞间的物质主要是蛋白质（胶原纤维）。胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。胰蛋白酶作用的适宜环境pH为7.2～8.4。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4。一、动物细胞培养过程4、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？

胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。

一、动物细胞培养过程5、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？

动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，它们的细胞分化程度低，增殖能力强，分裂旺盛，容易培养。一、动物细胞培养过程3、动物细胞培养过程中几个重要的概念1.细胞贴壁：

悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上（单层）。要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。2.接触抑制：

当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。细胞贴壁过程接触抑制：细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。50代以后失去接触抑制接触抑制动物细胞生长特性部分细胞突变，获得不死性，向癌细胞方向发展，糖蛋白减少。3.原代培养(primaryculture)定义：把第1代细胞的培养与传10代以内的细胞培养统称为原代培养。过程：从动物机体中取出组织剪碎加胰蛋白酶细胞游离加培养液将细胞接种到培养瓶内培养（1--2天换一次培养液）细胞贴壁生长长成单层细胞定义：当原代培养的细胞生长停止，这时如果要使细胞继续生长，就要及时用胰蛋白酶等，使细胞从瓶壁上解离下来，然后加入新的培养液，将细胞分离稀释，并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内，这个过程称传代培养4.传代培养(subculture)

细胞株：从原代培养细胞群中筛选出进行传代培养的细胞，能传到40-50代，其遗传物质没有发生变化。

细胞系：传到40-50代后有部分细胞遗传物质发生了变化，带有癌变的特点，可能在培养条件下无限制的传代下去，这种传代细胞称为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。细胞悬浮液10代细胞50代细胞无限传代原代培养传代培养细胞株细胞系知识点小结：各个新名词之间的联系多数组织细胞固定在表面生长和分裂。随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖遗传物质改变1、无菌、无毒的环境添加一定量的抗生素，定期更换培养液2、营养（葡萄糖、氨基酸、促生长因子，无机盐、维生素、动物血清、微量元素等）3、温度和PH

温度36.5+0.5度，pH7.2～7.44、气体环境

O2和CO2（95%空气和5%CO2

）4、动物细胞培养条件保证细胞顺利的生长增殖离体培养的细胞对微生物和有毒物质没有防御能力调节培养液PH值思考：动物血清的作用？主要是：提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子或提供合成培养基所缺乏的营养物质等。动物细胞培养液的主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。（1）液体培养基（2）含有动物血清动物体细胞大都生活在液体的环境植物组织培养呢？无机盐、蔗糖、维生素、生长调节物质、植物激素成分比较：与植物培养基相比其特点是：5、动物细胞培养技术的应用（1）生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。（3）用于检测有毒物质（2）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。（4）用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据（5）作为基因工程的受体细胞获得细胞细胞的全能性细胞株、细胞系植物体培养结果或细胞分泌蛋白快速繁殖、培育无病毒植株等培养目的葡萄糖、动物血清促生长因子蔗糖、植物激素培养基特有成分液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖原理动物细胞培养植物组织培养比较项目6、植物细胞和动物细胞培养的比较1.用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是

A．都需用培养箱

B．都须用液体培养基

C．都要在无菌条件下进行

D．都可体现细胞的全能性C巩固练习：外界条件适宜，植物细胞不需要。动物细胞培养一般需要培养箱。2、下列属于动物细胞培养与植物组织培养主要区别的是

A.培养基成分不同

B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行

C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能

D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株A3、动物细胞工程技术的基础是

A.动物细胞融合B.单克隆抗体

C.胚胎移植D.动物细胞培养D愈伤组织条件适宜可以传代培养不分化。4、细胞株的特点是

A．遗传物质没有改变，可以无限传代

B．遗传物质发生改变，不可无限传代

C．遗传物质没有改变，不可无限传代

D．遗传物质发生改变，且有癌变特点，可以无限传代

5、在动物细胞培养中有部分细胞可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称之为:A．原代培养B．传代培养

C．细胞株D．细胞系CD7.（09江苏）下图是一个新生小鼠的肝脏小块培养装置示意图。请回答下列问题。（1）肝脏切成小薄片，这有利于肝脏细胞

。（2）气室中充入5％C02：气体的主要作用是

。（3）培养液中添加抗生素是为了抑制细菌生长，但要注意选择抗生素的

，以保证抗生素对肝脏无害。吸收氧气和营养物质、排出代谢废物维持培养液适宜的pH种类和剂量08年宁夏卷回答下列有关动物细胞培养的问题：⑴在动物细胞培养的过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面

时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的

。此时，瓶壁上形成的细胞层数是

，要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是

。

⑵随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现

的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成

细胞，该种细胞的黏着性

，细胞膜表面蛋白质（糖蛋白）的量

。相互接触单层胰蛋白酶衰老甚至死亡接触抑制不死性降低减少⑷检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到

期的细胞用显微镜进行观察。⑸在细胞培养过程中，通常在

条件下保存细胞，因为在这种条件下，细胞中

的活性降低，细胞的

速率降低。⑹给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作

进行攻击。中冷冻酶新陈代谢抗原

既然动物体细胞核仍具有全能性，为什么不能直接利用动物体细胞培育动物体？

想一想利用动物体细胞核移植技术动物细胞的全能性会随着动物细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能逐渐变弱。

怎样才能使动物体细胞表现出全能性呢？

1.概念：将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。核移植难度高受体细胞：MⅡ期的卵母细胞三、动物体细胞核移植技术胚胎细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易用核移植的方法得到的动物称为克隆动物原理：动物细胞的细胞核具有全能性卵母细胞黑面母绵羊白面母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎卵裂C母绵羊子宫胚胎移植多莉羊分娩妊娠融合后的卵母细胞2.体细胞核移植过程电脉冲刺激供体细胞（供核）细胞培养体细胞卵巢卵母细胞（MⅡ中期：供质）去核无核卵母细胞注入细胞融合重组细胞构建重组胚胎胚胎移植代孕母体生出与供体奶牛遗传基本相同的犊牛归纳1.共分成两大阶段：核移植和胚胎移植2.取卵母细胞作受体细胞的原因是:它是最大的细胞,易操作；含有激发细胞核全能性的物质。3.严格来说新个体有卵母细胞的细胞质所以有两个亲本的性状。2.体细胞核移植过程供体细胞培养（MⅡ卵母细胞）减数第二次分裂中期去核的卵母细胞供体细胞注入去核卵母细胞受体细胞激活，完成减数分裂、发育胚胎移植无性生殖2、为什么不是取供体细胞核进行核移植操作，而是直接将供体细胞整个注入去核卵母细胞中？保证供核不被破坏，使所得个体的性状更符合供体。想一想

1、受体细胞为什么选用卵母细胞？

卵母细胞体积大，易操作，而且含有促使细胞核表达全能性的某种物质和营养物质。

2.体细胞核移植的过程P49讨论：

为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自具有优良性状动物提供的体细胞。1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？

培养的动物细胞一般当传代至10～50代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。2.体细胞核移植技术的应用前景1、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程。2、保护濒危物种。3、医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官的移植。克隆动物的研究意义1.克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白2.改良动物品种3.治疗人类疾病，作为供体4.保护濒危动物3.体细胞核移植技术存在的问题⑴许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，免疫失调等。⑵成功率非常低及克隆动物食品的安全性问题。体细胞核移植技术存在的问题

许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。在研究方面，克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。在应用上，生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。一、动物细胞融合1.概念：

动物细胞融合（cellfusion）也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。

融合和形成的具有原来两个或多个细胞遗传物质的单核细胞，称为杂交细胞。2、原理：细胞膜的流动性3.融合过程：诱导融合的方法？诱导方法：物理方法：化学法：生物法：灭活的病毒电激等聚乙二醇（PEG)

为什么灭活的病毒能作诱导剂？3.融合过程：灭活病毒诱导细胞融合的原理：

病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏这些病原体的抗原结构。植物细胞杂交与动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合原理融合前处理使用的酶诱导方法主要用途细胞膜的流动性细胞的全能性细胞膜的流动性纤维素酶、果胶酶胰蛋白酶

物理方法（离心、振荡、电激）化学方法（PEG）物理、化学方法灭活的病毒获得杂种植株制备单克隆抗体去除细胞壁后诱导原生质体融合使细胞分散后诱导细胞融合4.意义：

突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。5.应用：最重要的用途是制备单克隆抗体思考？1.抗体由何种细胞产生？如何产生？2.抗体的化学本质是什么？与抗原作用的特点？主要分布在哪里？3.用传统的方法如何获得抗体？(三)单克隆抗体抗体的传统生产方法从血清中分离抗体该法制备抗体的特点：

产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。多种效应B细胞动物体内多种抗体抗原单克隆抗体的制备单克隆抗体:单个细胞克隆产生的化学性质单一特异性强的抗体利用效应B细胞产生抗体的功能利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得杂交瘤细胞利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞设计方案：1、过程

注射抗原已免疫的B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选，继续培养足够数量的、能产生特定抗体的细胞群体外培养注射到小鼠腹腔单克隆