酶工程-02-微生物发酵产酶

酶工程

EnzymeEngineering第二课微生物发酵产酶TheProductionofEnzymebyFermentationofMicroorganism微生物发酵产酶概述酶的发酵生产经预先设计，通过人工操作控制，利用细胞的生命活动，获得人们所需的酶的过程前提——选育到性能优良的产酶微生物生产方式固体培养——霉菌液体深层发酵——现代发酵工业的主要方式固定化培养——固定化细胞、固定化原生质体微生物发酵产酶本章主要内容微生物细胞中酶生物合成的调节产酶微生物的特点以及酶发酵生产常用的微生物发酵工艺条件及控制酶发酵动力学概述固定化细胞发酵产酶固定化原生质体发酵产酶微生物发酵产酶酶生物合成的基本理论酶是蛋白质——如何获得蛋白？——蛋白生物合成从基因到蛋白质：遗传信息的传递——中心法则要生物合成一个酶，首先应知道这个酶对应的基因生成的多肽链必须经过正确的加工修饰，并正确折叠，才能生成有活性的酶转录和翻译中的生物调节作用微生物发酵产酶酶生物合成的过程RNA的合成——转录以DNA为模板，以核苷三磷酸（dNTP）为底物，在RNA聚合酶作用下，生成RNA的过程起始延伸终止转录后修饰：切除非编码区，碱基修饰，获得成熟的mRNA微生物发酵产酶酶生物合成的过程肽链的合成——翻译以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子，合成多肽链的过程氨基酸活化生成氨酰-tRNA肽链合成起始微生物发酵产酶酶生物合成的过程肽链的合成——翻译肽链延伸肽链合成的终止肽链翻译后加工Met/fMet切除—S—S—肽链折叠……微生物发酵产酶酶生物合成的调节组成型酶（constitutiveenzyme）在细胞中的量比较恒定，环境因素对这类酶的合成速率影响不大适应型酶（adaptiveenzyme）在细胞中含量变化很大，其合成速率受环境因素影响显著在所有的生物中，转录水平的调节控制（基因的调节控制）对酶的生物合成至关重要原核生物中酶生物合成的调节主要发生在转录水平微生物发酵产酶酶生物合成的调节——转录水平操纵子学说（operontheory）与生物合成相关的四个基因调节基因(regulatorgene)启动基因(promotergene)操纵基因(operatorgene)结构基因(structuralgene)调节的主要原理调节基因阻遏蛋白结合效应物结构变化亲和力变化阻遏蛋白与操纵基因结合，产生空间排斥作用，妨碍RNA聚合酶与启动基因结合，阻碍RNA的转录效应物结合阻遏蛋白之后，阻遏蛋白结构改变，不能结合操纵基因，RNA聚合酶可以结合启动位点，进行转录微生物发酵产酶酶生物合成的调节

——转录水平操纵子学说——启动基因的两个位点(1)RNA聚合酶结合位点(2)cAMP-CAP复合物结合位点

只有cAMP-CAP复合物到达启动基因位点时，RNA聚合酶才能顺利结合到相应位点，开始转录。微生物发酵产酶酶生物合成的调节——转录水平操纵子学说（operontheory）操纵子——结构基因+操纵基因+启动基因诱导型操纵子（inducibleoperon）诱导物激发基因大量表达乳糖操纵子（Lacoperon）阻遏型操纵子（repressibleoperon）阻遏物妨碍基因的正常表达色氨酸操纵子（Trpoperon）微生物发酵产酶酶生物合成的调节——转录水平调节模式1：分解代谢物阻遏作用某些物质（容易利用的碳源）经过分解代谢产生的物质阻遏了某些诱导酶生物合成的现象连锁效应实质——cAMP通过启动基因调控酶的合成解决——添加cAMP，控制易用碳源的用量微生物发酵产酶酶生物合成的调节

——转录水平调节模式2：诱导作用加入某些物质（诱导物）使酶的生物合成开始或加速进行的现象。诱导物（inducer）酶催化作用的底物或其底物类似物微生物发酵产酶酶生物合成的调节

——转录水平调节模式3：反馈阻遏作用即产物阻遏，是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象阻遏物（repressor）一般是酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物阻遏物+阻遏蛋白O基因微生物发酵产酶酶生物合成的模式（重点）微生物细胞生长曲线（四阶段）延迟期（调整期）生长期（对数生长期）平衡期衰退期酶的生物合成模式（四类）

——根据酶产生与细胞生长的关系同步合成型延续合成型中期合成型滞后合成型微生物发酵产酶酶生物合成的模式酶生物合成的四种模式时间细胞/酶浓度同步合成型时间细胞/酶浓度延续合成型时间细胞/酶浓度中期合成型时间细胞/酶浓度滞后合成型细胞浓度酶浓度微生物发酵产酶酶生物合成的模式同步合成型酶的生物合成与细胞生长同步进行（生长偶联

型）大部分组成酶属于此类此类酶的合成可由其诱导物诱导生成，不受分解代谢物阻遏和反馈阻遏作用酶对应的mRNA很不稳定典型例子：米曲霉培养生产单宁酶[EC3.1.1.20]（书p36图2-8）时间细胞/酶浓度细胞浓度酶浓度微生物发酵产酶酶生物合成的模式延续合成型酶的合成伴随着细胞的生长而开始，生长进入平衡期后，酶还能延续合成一段时间此类酶的合成可被诱导物所诱导，一般不受分解代谢物阻遏此类酶所对应的mRNA稳定性好举例：黑曲霉培养生产聚半乳糖醛酸酶[3.2.1.15]（书p37图2-9）时间细胞/酶浓度细胞浓度酶浓度微生物发酵产酶酶生物合成的模式中期合成型酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随之停止酶的合成受到产物的反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用酶所对应的mRNA稳定性较差举例：枯草杆菌碱性磷酸酶[EC3.1.3.1]受其水解产物磷酸的反馈阻遏作用（书p38图2-10）时间细胞/酶浓度细胞浓度酶浓度微生物发酵产酶酶生物合成的模式滞后合成型当细胞生长一段时间或进入平衡期后，才开始合成并大量积累酶许多水解酶属于此类阻遏物的存在延缓了酶的合成此类酶的mRNA稳定性好滞后合成型↔延续合成型举例：黑曲霉酸性蛋白酶[EC3.4.23.6]（书p38图2-11）时间细胞/酶浓度细胞浓度酶浓度微生物发酵产酶酶生物合成的模式Summary关键因素酶对应的mRNA稳定性培养基中是否存在阻遏物在酶发酵生产中，为提高产酶速率和缩短发酵周期，延续合成型是最理想的合成模式通过基因工程、代谢工程、细胞工程等手段，筛选优良菌株，使合成模式接近延续合成型。细胞浓度酶浓度微生物发酵产酶第二节产酶微生物的特点1.酶的产量高通过筛选获得高产菌株？，妥善保存并定期复壮？。2.容易培养和管理对培养基成分和工艺条件没有苛刻的要求，容易生长，适应能力强，易于控制，便于管理。3.产酶稳定性好能稳定生长并表达所需的酶，菌种不易退化。4.有利于酶的分离纯化酶的分离提纯要比较容易，能获得较高纯度。5.安全可靠产酶微生物及其代谢产物安全无毒，要求菌种对环境及对操作人员安全，不产生不良影响。获得高产菌株的方法：反复的筛选、诱变、基因工程、细胞或原生质体融合。复壮的方法：单细胞分离，纯化，扩大培养；诱变处理淘汰退化型；对于寄生性的微生物，采用接种至昆虫或动植物体内进行恢复。微生物发酵产酶产酶微生物的特点产酶微生物的分离和筛选一般流程：样品的采集：从富含该酶作用底物的场所采集样品富集培养：投其所好，取其所抗菌种纯化与分离：微生物的纯培养初筛：选出产酶菌种，以量为主复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主微生物发酵产酶产酶微生物的特点例：-淀粉酶生产菌的筛选

产-淀粉酶的微生物可以淀粉为碳源加以利用，在含KI-I2的淀粉培养基上，菌落周围因分泌出的-淀粉酶将淀粉水解而导致蓝色消失，生成“水解圈”。微生物发酵产酶产酶微生物的特点例：蛋白酶生产菌的筛选

在培养基中添加酪蛋白，经蛋白酶的水解，培养基相应位置变为澄清的“水解圈”。微生物发酵产酶产酶微生物的特点酶在微生物细胞中的存在形式胞外酶微生物为了利用环境中的大分子而释放到细胞外的；即使胞外浓度很高，胞内也能维持较低水平，受到的调节控制少；大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等）。胞内酶指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶；酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调控；微生物发酵产酶酶发酵生产常用的微生物细菌大肠杆菌（Escherichiacoli）枯草杆菌（Bacillussubtilis）——应用最广泛的产酶微生物放线菌链霉菌（Streptomyces）霉菌——使用种类最多的产酶微生物曲霉属、青霉、根霉等酵母啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）假丝酵母属（Candida）微生物发酵产酶酶发酵生产常用的微生物——细菌大肠杆菌（E.coli）一般产胞内酶主要的酶品种谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶等基因工程操作酶：限制性内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等枯草杆菌（B.subtilis）能产生多种胞外酶主要的酶品种淀粉酶类：如-淀粉酶（胞外）蛋白酶类：如中性蛋白酶（胞外）磷酸酶类：碱性磷酸酶（细胞间质）、5’-核苷酸酶等大肠杆菌特点：细胞呈现杆状，有的近似球形，大小0.5um*（1.0-3.0um），一般无荚膜，无芽孢，革兰氏阴性，运动或不运动，运动者周生鞭毛。菌落特点：从白色到黄色，光滑闪光，扩展。枯草杆菌特点：细胞呈杆状，大小0.7-0.8um*2-3um，单个细胞，无荚膜，周生鞭毛，运动，革兰氏阳性菌，有芽孢（椭圆至柱状）。菌落特点：粗糙，不透明，不闪光，扩张，污白色或微带黄色。枯草芽孢杆菌微生物发酵产酶酶发酵生产常用的微生物——细菌枯草杆菌产果胶酶微生物发酵产酶酶发酵生产常用的微生物——放线菌链霉菌（Streptomyces）生产葡萄糖异构酶的主要微生物主要酶品种青霉素酰化酶、纤维素酶、几丁质酶、碱性/中性蛋白酶等含有丰富的16-羟化酶，用于甾体药物转化放线菌特点：具有分支状菌丝的单细胞原核微生物，革兰氏阳性菌，具有气生菌丝和基内菌丝。菌落特点：呈放射状，具有分支的菌丝体。微生物发酵产酶酶发酵生产常用的微生物——放线菌链霉菌产聚乙烯醇降解酶微生物发酵产酶酶发酵生产常用的微生物——霉菌（丝状真菌）黑曲霉（Aspergillusniger）可生产多种酶（胞内酶或胞外酶）主要酶品种糖化酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、纤维素酶等。米曲霉（Aspergillusoryzae）米曲霉中糖化酶和蛋白酶活力较强，因此广泛应用于酿造行业和食品行业。米曲霉为一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。主要酶品种糖化酶、果胶酶、氨基酰化酶、磷酸二酯酶、核酸酶等。微生物发酵产酶酶发酵生产常用的微生物——霉菌黑曲霉（A.niger）米曲霉（A.oryzae）微生物发酵产酶酶发酵生产常用的微生物——霉菌红曲霉属（Monascus）菌落成熟后产红色色素，颜色较深；腐生真菌，能耐受pH3.5和10%酒精，尤嗜乳酸；红曲霉中含有丰富的酶系，并且自身能合成生长素，无须外源供给，尤其是葡萄糖淀粉酶和蛋白酶等酶，在食品行业使用广泛主要酶品种。-淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、酯酶等微生物发酵产酶酶发酵生产常用的微生物——霉菌青霉属（Penicillium）属半知菌纲，也有的列入子囊菌纲；腐生真菌，存在于空气中及腐烂的物质表面；常用的工业发酵微生物，广泛用于有机酸、干酪和抗生素的生产。主要菌种和酶的种类：产黄青霉（Penicilliumchrysogenum）葡萄糖氧化酶、纤维素酶、果胶酶、青霉素酰化酶等橘青霉（Penicilliumcitrinum）脂肪酶、葡萄糖氧化酶、5’-磷酸二酯酶、核酸酶等微生物发酵产酶酶发酵生产常用的微生物——霉菌青霉属（Penicillium）微生物发酵产酶酶发酵生产常用的微生物——霉菌青霉产聚乙烯醇降解酶微生物发酵产酶酶发酵生产常用的微生物——霉菌木霉（Trichoderma）属于半知菌亚门，丛梗孢目，木霉属，常见的木霉有绿色木霉、康宁木霉等木霉具有较强分解纤维素能力，绿色木霉（T.viride）通常能够分泌高活性纤维素酶，对纤维素的分解能力很强，因此在木质素、纤维素丰富的基质上生长快，传播蔓延迅速菌落开始时为白色，致密，圆形，向四周扩展最后整个菌落全部变成绿色产纤维素酶

的重要菌株；亦用于生产17-羟化酶，可用于甾体药物转化微生物发酵产酶酶发酵生产常用的微生物——霉菌木霉（Trichoderma）木霉适应性很强，菌落扩展很快，特别在高温高湿度条件下几天内木霉菌落可遍布整个料面绿色木霉(T.viride)的菌落哈茨木霉(T.harzianum)的显微形态微生物发酵产酶酶发酵生产常用的微生物——霉菌根霉（Rhizopus）具有11-羟化酶，是用于甾体药物转化的重要菌株产酶品种糖化酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等毛霉（Mucor）毛霉能糖化淀粉并能生成少量乙醇，产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，我国多用来做豆腐乳、豆豉许多毛霉能产生草酸、乳酸、琥珀酸及甘油等产酶品种蛋白酶、糖化酶、-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等微生物发酵产酶酶发酵生产常用的微生物——霉菌根霉（Rhizopus）毛霉（Mucor）微生物发酵产酶酶发酵生产常用的微生物——酵母啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）广泛应用于食品工业细胞呈圆形、卵形、椭圆形，在麦芽汁培养基上菌落白色有光泽产酶品种醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、转化酶等微生物发酵产酶酶发酵生产常用的微生物——酵母假丝酵母属（Candida）细胞呈圆形、卵形或长形，出芽成假菌丝不产色素，在麦芽汁琼脂培养基上菌落乳白色或奶油色产酶品种脂肪酶、尿酸酶、转化酶、醇脱氢酶等产17-羟化酶，用于甾体药物转化具烷类代谢的酶系，可利用石油及其加工废料为碳源微生物发酵产酶酶发酵生产常用的微生物菌种的选择了解产某种酶的菌种有哪些对这些菌种的性质进行全面的考察产酶机理代谢途径营养组成生长和繁殖情况……考察菌种产酶的能力及稳定性考虑是否对菌种进行改良优化培养条件微生物发酵产酶第三节发酵工艺条件及其控制发酵工程（fermentationengineering）采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面。囊括了微生物学、化学工程、基因工程、细胞工程、机械工程和计算机软硬件工程的一个多学科工程。工业发酵过程厌氧发酵生产过程，如酒精，乳酸的生产。通气（有氧）发酵生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。微生物发酵产酶发酵工艺条件及其控制发酵工程的产品微生物发酵产酶发酵工艺条件及其控制发酵生产：从实验室到工业生产菌种筛选平板培养摇瓶试验发酵罐中试工业发酵生产上游下游微生物发酵产酶发酵工艺条件及其控制微生物发酵产酶发酵工艺条件及其控制发酵基本流程和步骤培养基（种子培养基、发酵培养基）的配制。培养基、发酵罐及辅助设备的消毒灭菌。将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发酵罐中。将接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物。产物抽提、精制，以得到合格的产品。回收或处理发酵过程中产生的废弃物和废水。微生物发酵产酶发酵工艺条件及其控制发酵工艺条件控制的主要内容细胞活化与扩大培养培养基的成分及其配制pH值调节温度的调节控制溶解氧的调节控制提高酶产量的措施微生物发酵产酶发酵工艺条件及其控制一、细胞活化与扩大培养菌种保藏短期保藏长期保藏菌种活化使用前接种于新鲜培养基上，培养，以恢复细胞生命活动能力。扩大培养为保证发酵时有足够数量的优质细胞，活化细胞要经一级至数级扩大培养。一般培养到细胞处于对数生长期为宜。采用孢子接种，则应培养至孢子成熟期。各有哪些方法？短期保藏方法：斜面包藏、低温保藏长期保藏方法：沙土管保藏、真空冷冻干燥保藏、石蜡油保藏法；微生物发酵产酶发酵工艺条件及其控制二、培养基的成分及其配制培养基的组成碳源、氮源、水、无机盐、生长因子……根据不同的微生物种类和不同的生长条件确定培养基成分，可通过查阅相关的手册获得培养基的成分书p44注意同一种细胞用于生产不同的酶时，培养基成分不一样。细胞在生长、增殖、发酵、产酶等各阶段所需营养成分有区别。尽量减少培养基中部分物质对产酶的阻遏作用。微生物发酵产酶发酵工艺条件及其控制三、pH值的调节和控制培养基pH值的显著影响三方面！H+或OH–

影响酶的解离和电荷分布情况，引起酶构象的变化。pH值影响细胞质膜的电荷状况，改变膜的通透性。pH对底物和产物的物理化学性质也存在影响（解离平衡、溶解度、反应活性等）。最适生长pH、最适生产pH细胞发酵产酶的最适pH值通常接近该酶反应的最适pH值，但一般不同于细胞生长的最适pH值。培养基的pH值在细胞生长和发酵过程中将发生变化因素？微生物发酵产酶发酵工艺条件及其控制四、温度的调节和控制生长温度与产酶温度往往不同，一般后者低于前者较低温度下，mRNA稳定性较高，延续酶的合成温度过低，微生物代谢速度减慢，将延长发酵周期在不同的发酵阶段存在不同的温度：发酵产热生物热（主要）——微生物在生长繁殖过程中产生的热量，来自于代谢过程，但是同时热量扩散散失，又会使温度降低，因此培养基的温度是两者综合作用的结果。其他热源（微弱）——机械热，蒸发热，辐射热。温度控制——热水升温、冷却水降温。温度的双重影响微生物发酵产酶发酵工艺条件及其控制五、溶解氧的调节控制O2是细胞呼吸所必需的，但细胞一般只能利用溶解氧，即溶解在培养基中的氧。培养基供氧——通气搅拌，维持溶解氧含量。耗氧速率KO2——耗氧速率，指单位时间内单位体积培养液中细胞的耗氧量，(mmolO2)·h-1·L-1QO2——细胞呼吸强度，指单位细胞量在单位时间内的耗氧量，(mmolO2)·h-1·(gDC)-1Ccell——细胞浓度，单位体积培养液中细胞质量，(gDC)·L-1微生物发酵产酶发酵工艺条件及其控制溶解氧的调节控制溶氧速率（溶氧系数Kd）单位体积发酵液在单位时间内溶解的氧的量，(mmolO2)·h-1·L-1当Kd=KO2

时，溶氧量恒定。溶氧量调节方法P49通气量：增大通气量提高KdO2

分压：提高O2

分压，可增加O2

溶解度，提高Kd气液接触时间：延长接触时间，可增加O2

溶解量。气液接触面积：增大接触面积能提高Kd改变培养液的性质：培养液的黏度大，易产生泡沫，影响O2

溶解。微生物发酵产酶发酵工艺条件及其控制六、提高酶产量的措施(1)添加诱导物酶的作用底物e.g. 乳糖-半乳糖苷酶，以乳糖代替葡萄糖，可以使-半乳糖苷酶表达量提高数千倍。酶的反应产物e.g. 半乳糖醛酸（果胶酶水解产物）果胶酶底物类似物e.g. 异丙基-β-硫代半乳糖苷IPTG

-半乳糖苷酶，IPTG的诱导效率比底物乳糖高几百倍微生物发酵产酶发酵工艺条件及其控制提高酶产量的措施(2)控制阻遏物浓度p51e.g.1：枯草杆菌碱性磷酸酶受其反应产物H3PO4

的阻遏。e.g.2：β-半乳糖苷酶受培养基中葡萄糖的阻遏。措施：控制速效性碳源的浓度，改用迟效性碳源，或添加cAMP，减少分解代谢物阻遏作用。及时分离末端产物，控制产物浓度在低水平，减弱或解除产物阻遏作用。微生物发酵产酶发酵工艺条件及其控制提高酶产量的措施(3)添加表面活性剂增加质膜的通透性，有利于胞外酶的分泌，提高酶的产量；添加表面活性剂有利于提高某些酶的稳定性和催化能量。一般采用毒性较小的非离子型表面活性剂e.g.：在木霉发酵生产纤维素酶的培养基中，添加1%吐温，可使产酶量最高提高20倍。提高酶产量的措施(4)添加产酶促进剂——作用机制不明e.g.：添加植酸钙镁可使霉菌蛋白酶和橘青霉磷酸二酯酶的产量提高1~20倍。微生物发酵产酶第四节酶发酵动力学概述发酵动力学研究发酵过程中细胞生长速率、产物生成速率、基质消耗速率及环境因素（如溶解氧）对这些速率的影响规律研究意义了解酶生物合成模式发酵工艺条件优化控制提高酶产量研究方法通过发酵实验数据的分析，建立通用的半经验

动力学模型，并用于一般的发酵过程微生物发酵产酶酶发酵动力学概述一、细胞生长动力学研究细胞生长速度及其受外界环境影响的规律1950年，Monod提出表述微生物生长的动力学方程，他认为，细胞生长速率（RX）与细胞浓度（X）成正比

——细胞的比生长速率，h-1假设培养基中只有一种限制性基质S，而不存在其他生长限制因素时，比生长速率为这种限制性基质浓度（S）的函数，即(2-1)酶发酵动力学概述一、细胞生长动力学Monod给出的表达式为S——限制性基质的浓度m——最大比生长速率（S

过量时），当S>>KS

时，

=mKS——Monod常数，当

=½m时，S=KS式

(2-2)

称为Monod生长动力学模型式

(2-2)

中不考虑细胞的死亡Monod方程是基本的细胞生长动力学方程，根据实际需要可以从不同情况出发对其进行修正微生物发酵产酶(2-2)微生物发酵产酶酶发酵动力学概述一、细胞生长动力学Monod方程与Michaelis-Menten方程比较双倒数形式：(1-7a)(2-2)(2-4)(1-7b)微生物发酵产酶酶发酵动力学概述一、细胞生长动力学Monod方程的修正——在连续全混流反应器发酵过程中，稳态时游离细胞连续发酵的生长动力学方程D——稀释速率（h-1），指单位时间内流加的培养液与发酵液体积之比D=0：分批发酵D<：dX/dt>0，表明细胞浓度增加D=：dX/dt=0，表明细胞浓度恒定（稳态）D>：dX/dt<0，表明细胞浓度下降，S相对升高，回升D>m：细胞浓度X

趋于零，无法达到新的稳态(2-3)微生物发酵产酶酶发酵动力学概述二、产酶动力学——宏观动力学（重点）产酶速率（RE）与细胞比生长速率（）、细胞浓度（X）等因素有关，即式(2-5)

称为宏观产酶动力学方程，式中：E——酶浓度，U·L-1RE——产酶速率，U·L-1·h-1X——细胞浓度，(gDC)·L-1——生长偶联的比产酶系数，U·(gDC)-1——非生长偶联的比产酶速率，U·(gDC)-1·h-1(2-5)微生物发酵产酶酶生物合成的模式酶生物合成的四种模式时间细胞/酶浓度同步合成型时间细胞/酶浓度延续合成型时间细胞/酶浓度中期合成型时间细胞/酶浓度滞后合成型细胞浓度酶浓度微生物发酵产酶酶发酵动力学概述二、产酶动力学——各种产酶模式下的宏观动力学方程1.同步合成型：

=0，则2.中期合成型：特殊的生长偶联型，

=0有阻遏存在时，

=0，无酶产生阻遏解除后才开始合成酶，此时时间细胞/酶浓度时间细胞/酶浓度中期合成型微生物发酵产酶酶发酵动力学概述二、产酶动力学——各种产酶模式下的宏观动力学方程3.滞后合成型：非生长偶联型，

=0，则4.延续合成型：部分生长偶联型，0，0时间细胞/酶浓度滞后合成型时间细胞/酶浓度延续合成型微生物发酵产酶第五节固定化微生物细胞发酵产酶固定化细胞的概念又称固定化活细胞、固定化增殖细胞。固定化细胞是用各种方法固定在载体上，在一定空间范围内进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。20世纪70年代后期发展起来的技术目前在发酵生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等胞外酶方面取得了成功微生物发酵产酶固定化微生物细胞发酵产酶一、固定化细胞发酵产酶的特点1.提高酶的产率——细胞固定化之后，单位空间内细胞密度增大，因此加速了生化反应不同发酵方式对-淀粉酶产酶率的影响微生物发酵产酶固定化微生物细胞发酵产酶固定化细胞发酵产酶的特点2.可以反复使用，可以在高稀释率下连续发酵，使用时间较长。3.提高基因工程菌质粒的稳定性，不易丢失。4.固定化细胞对pH值、温度等外界条件的适应范围增宽，对抑制剂的耐受能力增强，因此发酵稳定性好5.可先经预培养再转入发酵生产，缩短发酵周期，提高设备利用率6.固定化发酵是非均相体系，产品容易分离纯化7.一般只适用于胞外酶的生产微生物发酵产酶固定化微生物细胞发酵产酶二、固定化细胞发酵产酶的工艺条件及控制1.固定化细胞预培养目的——让细胞适应固定化之后的新的环境一般采用与产酶阶段不同的培养基2.温度控制适应范围较宽，在分批发酵和半连续发酵过程中不难控制；连续发酵时，由于稀释率（D）较高，反应器内温度变化较大，因此应预先调节流加液温度3.培养基组分控制培养基中某些物质影响固定化载体的结构，应控制这些物质的含量。微生物发酵产酶固定化微生物细胞发酵产酶固定化细胞发酵产酶的工艺条件及控制4.溶解氧的供给——限制性因素原因：传质问题解决思路加大通气量，但避免剧烈搅拌（气升式反应器）。改变固定化载体，如少用琼脂等对氧扩散不利的载体；在制备固定化载体时，采用多孔材料或人工致孔，增强溶解氧在载体内的扩散。添加能富集氧或有利于氧传递的物质。降低培养基的浓度和黏度。微生物发酵产酶固定化微生物细胞发酵产酶三、固定化细胞生长和产酶动力学基本原则在固定化细胞体系中细胞分两部分：一部分是固定在载体上的细胞，浓度基本稳定；另一部分是泄漏到培养液中的细胞，类似于游离细胞在描述时分两部分，按固定化细胞和游离细胞分开描述固定化细胞

游离细胞 酶活力时间细胞浓