感受态细胞的制备

实验三大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）1.实验目的2.实验原理3.实验仪器、材料与试剂4.实验步骤

5.实验结果与讨论

实验目的

学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。实验原理

受体细胞经过一些特殊方法(如电击法、CaCl2等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞）。实验仪器、材料与试剂1．超净工作台2．低温离心机3．恒温摇床4．恒温培养箱5．-70℃冰箱6．制冰机7．移液器50ul、200ul、1000ul（二）材料大肠杆菌DH5α（Top10）。（三）试剂

1.LB液体培养基2.0.1mol/LCaCl2溶液实验步骤

1.挑取大肠杆菌DH5α（Top10）的单菌落，接种于5mlLB液体培养基中，37℃振荡培养12hr。2.取2mL菌液加入100mlLB液体培养基中，扩大培养约2-3h；测OD600值，当OD600约0.4-0.5时，停止培养。3.无菌条件下取1.5ml菌液冰上放置10min，4℃，3,500rpm，离心10min。4.弃上清，在冰浴上加入250ul预冷的无菌CaCl2(0.1mol/L)，轻摇使细胞悬浮。冰上放置10min。5.4℃，3,500rpm离心10min。6.弃上清，用150ul预冷的无菌CaCl2(0.1mol/L)重新悬浮细胞，保存备用。（加入15%的甘油，-70℃保存，可保存一年）。注意事项1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3．经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；5．所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；7．一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；实验注意事项细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600

来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107

个/mL左右，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。1.在制备感受态细胞的实验中要注意哪些

细节？2.影响感受态细胞转化效率的因素有哪些？思考题实验结果与讨论