分子生物学专题

1IsolatingLABfromdifferentniches3

FoodgradevectorConstruction2SecondMetabolite4StressresponsemechanismofLAB1.1LABandBifidobacteriawereisolatedfromthedifferentniches(1)Atraditionallyfermenteddairyproductkoumiss

Unpasteurizedfreshhorse’sMilkfermentedwithLABandYeastEnhancingimmunity,treatingtuberculosisandsoon酸马奶是以鲜马奶为原料，经乳酸菌和酵母等微生物共同发酵而成酸性乳饮料。酸马奶具有降血压、降血脂和调节胃肠道疾病等医疗保健功能，研究表明乳酸菌发挥着非常重要的作用。(Montanaretal.1996;Wangetal.2008；Wu

etal.2009)存在问题：由于缺乏对传统发酵酸马奶中乳酸菌种类和组成的系统了解，目前尚无法开发出适宜工业化生产的发酵剂，阻碍了酸马奶工业化生产的进程。阻碍目标菌种鉴定方法参考文献L.plantarum

生化鉴定/16SrDNAAnY等；孙天松等L.pentosus

生化鉴定AnY等；熊素云等L.helveticus生化鉴定/16SrDNA孙天松等；Uchidak

等L.acidophilus生化鉴定/16SrDNA孙天松等；毕玉海等L.casei生化鉴定/16SrDNA孙天松等；毕玉海等L.paracasei生化鉴定/16SrDNA刘芳等；乌日娜等L.rhamnosus16SrDNA乌日娜等L.delbrueckii

生化鉴定/16SrDNA孙天松等；吴敬等L.fermentum生化鉴定/16SrDNA孙天松等；乌日娜等L.curvatus生化鉴定/16SrDNA孙天松等；乌日娜等L.kefiranofaciens16SrDNA乌日娜等L.kefiri16SrDNAUchidak

等Ln.Mensenteroides生化鉴定/16SrDNA刘芳等；贺银凤等E.facealis生化鉴定/16SrDNA乌日娜等；贺银凤等

酸马奶乳酸菌多样性研究进展

依赖于培养的方法及其局限性分离纯化得到纯菌形态学鉴定生理生化鉴定分子生物学鉴定局限性：标准培养基难以完全模拟环境条件，仅可对可培养的细菌进行研究，因此不能客观全面的反应样品中微生物的组成。不依赖于培养方法的优点不依赖于培养方法：

从样品中直接提取微生物总DNA

,利用分子生物学方法对微生物的种类和组成进行检测。变性梯度凝胶电泳时间温度梯度凝胶电泳末端限制性长度多态性优点检测速度快，可同时检测多个样品检测极限低，结果客观可靠可与培养方法结合非培养方法在发酵乳制品中的应用所用技术目标菌应用领域参考文献DGGE乳酸菌Sicilian干酪Randazzo,2002DGGE细菌Mozzarella干酪Ercolini,2004TTGE细菌人工制备干酪Ogier,2002DGGE/TTGE细菌商业干酪Ogier,2004DGGE细菌Lighvan干酪Kaflli,2009DGGE细菌Carbrales干酪Florez,2006TTGE细菌人工制备发酵奶Ogier,2002DGGE/TTGE细菌Zabady发酵奶El-Baradei,2008DGGE/TTGE细菌原料奶Lafarge,2004DGGE的原理及步骤原理：片段大小相同、碱基组成不同的双链DNA分子，在变性剂梯度凝胶电泳时因具有不同的解链温度而滞留于凝胶的不同位置，最终形成相互分开的谱带。酸马奶样品基因组提取靶基因序列PCR扩增混合DNA扩增产物（相同大小，不同序列）DGGE分析共迁移的原因及解决方法共迁移原因：但由于某些菌株的靶基因序列高度相似，DGGE时会发生共迁移现象，导致无法根据Marker比对和测序的方法进行鉴定。BegleyM,etal.ApplEnvironMicrobiol.2006,72(3):1729-1738解决方法：种特异性PCR可以根据编码基因的种特异性序列设计引物，通过对PCR产物的分析，精确鉴定存在共迁移的菌种。OgierM,etal.ApplEnvironMicrobiol.2002,72(3):1028-1032实验方案酸马奶样品的采集细菌总DNA的提取DGGE图谱的建立种特异性PCR鉴定共迁移条带无法比对条带进行测序鉴定利用比对Marker鉴定条带培养于不同的培养基活菌计数，确定乳酸菌主要菌属分离纯化分子方法鉴定为酸马奶中乳酸菌的开发奠定基础系统了解酸马奶中乳酸菌多样性，为商业发酵剂的开发提供参考实验结果与分析（一）种特异性PCR方法的建立酸马奶中可能存在共迁移菌种的确定优势菌种所属类群参考文献L.plantarumL.pentosus植物乳杆菌类群AnY等；孙天松等；毕玉海等；吴敬等；刘芳等；乌日娜等；Uchidak

等AnY等；熊素云等L.helveticusL.acidophilus

嗜酸乳杆菌类群孙天松等；Uchidak

等；乌日娜等孙天松等；毕玉海等；刘芳等；乌日娜等L.caseiL.paracasei干酪乳杆菌类群孙天松等；毕玉海等；吴敬等；刘芳等；乌日娜等；熊素云等；贺银凤等刘芳等；乌日娜等；Uchidak

等三大类群乳酸菌种特异性PCR引物的确定目标菌种引物

序列（5’-3’）

产

物大小(bp)

退火

温度（℃）参考文献L.PentosuspentFCAGTGGCGCGGTTGATATC21862Torriani,

2001PrevTCGGGATTACCAAACATCACL.plantarumplanFCCGTTTATGCGGAACACCTA31858pREVTCGGGATTACCAAACATCACL.helveticusPeCfCTGTTTTCAATGTTGCAAGTC52464Fortina,

2001PeCrTTTGCCAGCATTAACAAGTCTL.acidophilusAci16SIAGCTGAACCAACAGATTCAC74062Walter,200016SIIACTACCAGGGTATCTAATCCL.caseiCaseiTGCACTGAGATTCGACTTAA29055Ward,1999Y2CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTL.paracaseiParaCACCGAGATTCAACATGG29055Y2CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT酸马奶乳酸菌专用鉴定Marker的建立目标菌株的确定：参照传统方法的分离结果，选择出现2次以上的乳酸菌，作为鉴定Marker的参考菌株。编号1234567菌种植物乳杆菌戊糖乳杆菌发酵乳杆菌肠膜明串珠菌嗜酸乳杆菌瑞士乳杆菌弯曲乳杆菌编号8910111213菌种粪肠球菌乳酸乳球菌嗜热链球菌干酪乳杆菌副干酪乳杆菌鼠李糖乳杆菌鉴定Marker选用的参考菌株利用DGGE检测酸马奶乳酸菌的多样性

参考菌株基因组的检测结果16SrDNAV3区外侧700bp片段扩增结果16SrDNAV3区序列扩增结果参考菌株的基因组提取及靶序列扩增6株菌无共迁移，可以直接通过Marker进行鉴定。7株菌存在共迁移现象，分属于乳酸菌中的三大类群。鉴定Marker的DGGE图谱酸马奶乳酸菌DGGE图谱的建立

酸马奶样品的采集采样区县尼勒克县新源县采样地点狗熊沟那拉提种蜂场卡普河则可台采样份数1181198酸马奶中乳酸菌总DNA的提取提取方法的确定：采用溶菌酶-酚仿抽提的方法，并根据酸马奶的性质，在前处理上略加改进。酸马奶样品总DNA的检测结果Ogier,etal.ApplEnvironMicrobiol.2002,72(3):1729-1738酸马奶样品DGGE图谱的建立9个条带通过鉴定Marker直接鉴定。11个条带无法通过Marker直接比对，通过测序鉴定。通过种特异性PCR鉴定共迁移条带。DGGE图谱条带测序鉴定结果

条带编号

亲缘关系最近种属相似度(%)

序列号cUnculturedbacteriumclonenbw741c09c116SribosomalRNAgene100GQ011256.1d′Unculturedbacteriumpartial16SrRNAgene,cloneFC04D11100FM873249.1eLactobacillusjensenii95DQ317562.1hLactobacilluskefiranofaciens100AB372208.1iLactobacilluskitasatonis

99NR_024813.1jLactobacillussp.GTP516SribosomalRNAgene98AF157035.1lUnculturedbacteriumclonesic_616SribosomalRNAgene94GQ175531.1nLactobacilluskefiri92AB42937.1pUnculturedbacteriumclone14LED0416SribosomalRNAgene98FJ163966.1qLactobacillusbuchneri92FJ867641.1q′Unculturedbacteriumclone14LEJ0516SribosomalRNAgene94FJ163981.1DGGE结果小结

新疆地区酸马奶中含有植物乳杆菌、发酵乳杆菌等18种乳酸菌。酸马奶中的主要乳酸菌是嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、发酵乳杆菌和马奶酒样乳杆菌。本研究首次在酸马奶中发现了布氏乳杆菌、詹氏乳杆菌和卡氏乳杆菌，前人使用培养方法对酸马奶的研究中均未见报道。(2)FecesofHealthyChineseCentenarian

7personswereolderthan100yearsoldin555persons

Thisratioisasmuch200timesastheinternationalstandardoflongevitycountryside1.2.1细菌素简介片球菌素

细菌素：由某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成的一类具有抑菌生物活性的肽或前体。抗菌的对象主要是与产生菌分类上相近的细菌。（1）I类为羊毛硫细菌素：分子内硫醚环中含有稀有氨基酸

修饰后的小肽（小于5kDa），例如Nisin。（2）II类细菌素是不含羊毛硫氨酸、非修饰、分子量小于10kDa、热稳定的、富含小氨基酸，通常为阳离子亲

水亲脂的两性物质，例如：片球菌素pediocinPA-1.

Secondmetabolite-IIabacteriocinCommonmechanismsoftargetcellrecognitionandimmunityforclassIIbacteriocins,2007,PNASPedBImmunityproteinPedBtopediocinPA-1ModeloftargetcellkillingandimmunityforClassIIaBcteriocin硕士课题利用定点突变技术将免疫蛋白PedB的46位点的赖氨酸进行突变成带正电、带负电和不带电荷的氨基酸，检测各突变体对细菌素的敏感性，以阐明46位点的赖氨酸对其免疫活性的影响。二、立题依据与意义3.2.4定点突变技术路线不带电荷精氨酸-Arg带正电荷天冬氨酸-Asp谷氨酸-Glu带负电荷

谷氨酰胺-Gln

Textinhere赖氨酸+++++亮氨酸-LeuFig.5.Detectionofthewild-typeandmutatedfPedBproteinsbyimmunoblottinganalysis3.3携带野生型免疫蛋白基因或突变基因的植物乳杆菌对细菌素的敏感性分析菌株敏感性抑菌圈对照质粒pNZ81481pNZfPedB128pNZfK46Q1pNZfK46T1pNZfK46D1pNZfK46E1pNZfK46R1免疫蛋白的表达在一定程度上对宿主细胞起到了保护作用。免疫蛋白各突变体的活性均丧失，而且保守突变（K-R）的活性亦丧失。原核基因的结构－35区－10区5非翻译区3非翻译区原核生物基因：多顺反子，多基因产物启动子含有SD序列，与核糖体结合启动翻译。与RNA聚合酶结合启动转录ATGTAA转录单位终止子编码区真核生物基因的结构增强子CCAAT盒TATA盒5非翻译区3非翻译区内含子终止子启动子转录后具有帽子结构，与核糖体结合启动翻译。与RNA聚合酶结合启动转录5’上游区3’下游区转录区

转录起始位点（＋1）外显子复制子：是一段包含复制起始位点（ori）和有关序列在内的DNA片段，常见的pMB1、ColEI和pSC101等。选择标记：抗生素抗性基因严紧型质粒和松弛型质粒

1.DNA的复制复制子和选择标记原核表达载体的构成（1）启动子（Promoter）定义：是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。

2.转录系统启动子和终止子在一个基因的3’末端或1个操纵子的3’末端往往还有一特定的核苷酸序列，具有终止转录的功能。（2）转录终止子（3）翻译系统（1）核糖体结合位点：指原核基因转录起始位点下游的一段DNA序列，即Shine-Dalgarno序列（简称SD序列）（2）翻译起始密码子：位于SD序列下游，通常为AUG（ATG），编码甲硫氨酸。（3）翻译终止密码子

与核糖体相遇时，能使核糖体从mRNA模板上脱落，终止蛋白质的翻译过程。

食品级表达载体

(Food-GradeExpressionVector)筛选标记：采用无毒无害食品级的筛选标记定义：表达载体不得含非食品级的功能性DNA片段

（3）食品级筛选标记基因国内外研究的情况筛选标记编码基因参考文献蜜二糖发酵agaLabrieetal.,2005,J.DairySci.蔗糖发酵scrA/scrBLeenhouts,1998,AEM木糖发酵xylA,xylB,xylRPosnoetal.,1991,AEMNisin抗性nisI,nsrHughesetal.,1992,J.DairySci.;Takalaetal.,2002,AEM乳杆菌素F免疫lafIAllisonetal.,1996,AEM热激抗性shspElDemerdashetal.,2003,AEM噬菌体抗性Ads,R/M,AbiO’Sullivanetal.,2001,AEM

本课题选用胆盐水解酶作为筛选标记的原因？大多数乳酸菌对胆盐胁迫敏感，因此胆盐水解酶可以作为乳酸菌表达载体的筛选标记胆盐水解酶能够提高宿主菌株对胆盐的耐受性，从而提高其在肠道中的存活率胆盐水解酶可以降低血清中的胆固醇，携带胆盐水解酶活性的菌株具有潜在的益生功效1.3FoodgradevectorconstructionFig.2.BSHactivityanalysis

Transformationefficiencywas4×104CFU/µgCatalaseactivityanalysis1.4Acidstressresponse（1）酸奶对人体具有重要的益生保健功能

更易于人体的消化吸收，且不会导致乳糖不耐症（2）后酸化问题：酸奶在正常发酵结束后的贮存、运输和

销售过程中，发酵微生物的继续生长会导致产品pH值

持续降低，进而发生后酸化现象。立题依据1.1酸奶的营养价值及生产中存在的问题（3）保加利亚乳杆菌是导致后酸化的主要原因

保加利亚乳杆菌可以继续发酵乳糖产酸，使酸奶的pH

值下降到3.5左右，从而导致酸奶制品发生后酸化。国内外

酸奶后酸化控制措施的研究进展（1）提高发酵剂中嗜热链球菌对保加利亚乳杆菌的比例

（Torrianietal.,1996；徐成勇等，2007）（2）添加外源抑菌物质控制发酵后期菌体的生长和产酸

（Bayoumi,1991；曹维强等，2005；鲍盈盈等，2009）（3）选育在低温条件下产酸微弱的保加利亚乳杆菌

（Ongoletal.,2007）丹麦汉森(Chr.Hansen)公司研发了弱后酸化保加利亚菌的制备技术，申请了低后酸化乳酸菌专利（CN101472481），弱后酸化发酵剂（YF-L812、ST-BODY-3、LA-5和BB-46）（1）质子泵F0F1-ATPase

（Arikadoetal.,1999）（2）谷氨酸脱羧酶途径GAD

（Sandersetal.,1998）（3）精氨酸脱氨酶途径ADI

（Curranetal.,1995;DeAngelisetal.,2002）（4）应激蛋白和分子伴侣蛋白

（Hartkeetal.,1996；Coxetal.,2000）（4）改变细胞膜的脂肪酸构成

（CotterandHill,2003）（fromCotterandHill,2003）乳酸菌酸耐受机制的研究进展保加利亚乳杆菌的酸耐受机制的特殊性对保加利亚乳杆菌全基因组序列的分析表明,仅具有F0F1-ATPase基因簇缺失一些存在于其他乳酸菌中的pH调节相关的基因，如ADI途径中的arcA,B,C,T,D,R基因和GAD途径中的gadC,B基因（vandeGuchteetal.,2006）立题意义进一步揭示保加利亚乳杆菌酸耐受机制；为制备弱后酸化的保加利亚乳杆菌奠定基础；为开发具有自主知识产权的酸奶发酵剂提供理论依据。细菌单杂交（BacterialOne-Hybrid,B1H）概念：将酵母单杂交系统的筛选标记HIS3和URA3转移到大肠杆菌宿主内，通过标记基因的表型检测，研究转录调控因子(transcriptionfactor,TF)与DNA的相互作用。参考文献Meng,X.andWolfe,S.A.(2006)IdentifyingDNAsequencesrecognizedbyatranscriptionfactorusingabacterialone-hybridsystem.Nat.Protocol,1,30-45.细菌单杂交原理宿主：E.coliUS0ΔhisB

ΔpyrFbindingsequenceorrandomizedcassettes5-FOAnegativeselection当不含TF时，某些随机DNA片段可能有启动子活性，激活HIS3和URA3表达，URA3表达产物能降解5-FOA，产生有毒物质，菌体死亡，因此可去除假阳性干扰。3-ATpositiveselection当TF与bindingsequence正常结合时，激活HIS3表达，参与合成组氨酸，能够在组氨酸缺陷培养基中生长，3-AT作为HIS3的竞争性抑制物，提高筛选的准确性。细菌单杂交的应用——预测未知TF的DNA识别位点L.bulgaricusCAUH1中转录因子Ldb0677的识别位点构建随机DNA片段文库构建携带TF-Ldb0677的诱饵载体ldb0677US0SequencingWesternboltDH5a18bprandomizedcassettes18bp5-FOAselection18bpPurifiedPreylibraryn’US03-AT筛选——5-30mM3-AT预测Ldb0677的bindingsite18bpPurifiedPreylibraryUS0+Ldb06773-ATplate3-ATselection3-ATplate随机挑选单菌落测序MEME分析Putativebindingsequence细菌单杂交的应用——鉴定调控已知基因转录的TF鉴定L.bulgaricusCAUH1中调控pyk基因转录的TF构建L.bulgaricusCAUH1的TF文库CAUH1TFsUS0“Prey”SequencingWesternblotCAUH1TFlibrary3-AT筛选US0+pH3U3-pyk3-ATplate3-ATselectionCAUH1TFlibrarySequencingpB1H2-TFUS0+pH3U3-pyk3-ATplate3-ATselectionpB1H2CK2.