第十三单倍体诱导和育种细胞工程

第十三章单倍体诱导和育种

主要内容植物小孢子发育过程花粉和花药培养条件花粉和花药培养方法单倍体诱导的应用植物单倍体的概念和来源

相关概念植物减数分裂后形成的雌雄配子，其染色体数只有体细胞的一半，将这具有单套染色体的细胞称为单倍体细胞。单倍体细胞在人工离体条件下培养，使其单性发育成植物体，这种只具有单套染色体的植物称为单倍体植物。单倍体的主要类型

具有来自二倍体染色体数目一半的单倍体（也称一倍体）和具有来自多倍体种染色体数目一半的多倍单倍体。单倍体的一般概念是适用于起源于孢子体发生和含有一半染色体的任何植物。单倍体育种：将具有单套染色体的单倍体植物，经人工染色体加倍，使其成为纯和二倍体，从中筛选优良个体，直接繁育成新品种，或具有单一优良性状的个体，作为杂交育种的原始材料。人工诱导单倍体发生形式

孤雄生殖－离体培养花药或花粉，诱发小孢子单性发育成单倍体植物。（广泛使用）孤雌生殖－离体培养未受精的子房或胚珠，诱发卵细胞单性发育成植物体。（诱发频率低）第一节植物小孢子发育过程药隔：花药中部，由薄壁细胞构成，内有维管束花药花粉囊（4或2）囊壁花粉粒表皮纤维层花药的结构花粉母细胞到成熟花粉粒过程1）四分体孢子时期：（第一期）花粉母细胞减数分裂四分体（未成熟的花粉粒、小孢子，n）2）单核期（第二期）四分体后，小孢子分开，中央有核液泡增大，液泡将花粉粒挤向一边单核早期：细胞小，核大，无液泡，居中，单核中期：细胞大，核大，有液泡，居中，单核晚期：液泡增大，核靠边（单核靠边期）

3）双核期（第三期）核：大核：营养细胞小核：生殖细胞—分裂--两个精子（雄配子）三核花粉。

多数在单核靠边期培养为最佳。一、植物的花粉发育②花粉粒的形成花粉母细胞（小孢子母细胞）减数分裂①经历时期：四分体时期、单核期、双核期四分体时期（进入单核期）有丝分裂单核靠边期(小孢子)单核居中期(小孢子)小孢子（单核花粉粒）精子精子有丝分裂花粉管细胞核生殖细胞核生殖细胞营养细胞双核期两个精子和一个营养核的基因型相同1花粉母细胞4个小孢子减分有分4个花粉管细胞核4个生殖细胞核有分8个精子花粉粒类型一个成熟的花粉粒即为雄配子体，有两种情况：二核花粉粒:成熟的花粉粒中，只含花粉管细胞核和生殖细胞核。（精子在花粉管中形成）三核花粉粒:有些植物的花粉，在成熟前，生殖细胞进行一次有丝分裂，形成两个精子，这样的花粉在成熟时，含有一个营养核和两个精子。第二节花药和花粉培养一、花药培养

1964年：Guha&Maheshwari南洋金花花药培养发育成胚；1967年：Bourgin&Nitsch花药培养获得烟草植株；1973年：我国首次报道了小麦花药培养获得再生植株；目前：许多农作物及经济植物通过花粉培养都能诱导成植株。（一）再生方式1.器官再生：容易发生倍性的变化。2.胚状体再生特点：

（1）两极性

（2）与外植体维管束无联系花药再生植株的方式

（二）材料的选取最常用的方法有醋酸洋红法（三）材料的消毒1、酒精处理①花蕾用体积分数为70%的酒精浸泡30秒，立即取出。②无菌水清洗③无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分2、消毒液处理（四）接种和培养①放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中2-4分钟（也可质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液）②无菌水冲洗3-5次用于培养花药，实际上多数未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药②要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成立即将花药接种于培养基上，通常每瓶接种花药7-10个。1、剥取花药①勿损伤花药，以免诱导出非花粉愈伤组织2、接种注意：①培养条件：温度控制在25℃左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。

3、培养②培养：一般经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体长出愈伤组织则将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株③注意：如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变化（主要原因是营养核和生殖核融合造成的）4、鉴定和筛选花药培养的优缺点优点：

1.不需要进行游离花粉的处理。

2.不需要特殊的培养方法。缺点：

1.花药体细胞形成二倍体植株。

2.对后代要进行进一步的筛选。二花粉培养（一）定义：指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒为外植体进行离体培养，获得单倍体植株的技术。花粉培养的优点：1.排除了体细胞的影响。2.花粉较小，所需器皿和培养空间较小。3.花粉可以成为基因工程的受体。花粉培养的缺点1.需要对花粉进行收集（1）挤压法（2）散落法（3）器械法2.需要特别的培养方法（二）裸子植物的花粉培养研究较少，容易发生突变常用植物有：麻黄；银杏；紫杉；榧麻黄会自动裂开。银杏和榧需收集后才能进行。（三）被子植物的花粉培养较难进行，需要特殊处理悬滴培养看护培养（滤纸）植板培养（混合琼脂固体培养基）看护培养法

取出花粉，制成每ml含有20个花粉粒的细胞悬浮液。看护培养时，把花药放在琼脂培养基表面上，然后在每个花药上覆盖一小块圆片滤纸。用移液管吸取1滴已准备好的花粉粒悬浮液，滴在每个小圆片滤纸上培养，在25℃和一定光照强度下，大约一个月长出细胞群。由于完整的花药发育过程释放出有利于花粉发育的物质，并通过滤纸供给花粉，促进了花粉的发育。植板培养法含义：是将花粉悬浮液与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养方法。该方法是Bergmann(1960年)首创。

特点：可以定点观察；花粉粒外壁涨破，细胞团被释放出来。培养细胞气体交换不畅。花药材料的选取关键选取处于合适发育期的花粉，离体培养后才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双核期的花粉，均有可能诱导离体孤雄发育。大多数园艺植物的花粉培养，成功率最高的时期为单核期，或单核中晚期。花粉培养选幼年树花蕾取下花蕾（镜检）预培养数天取花药接种分离花粉药壁向花粉提供营养物质；通过药壁吸收、贮存和转化培养基中的外源物质低温预处理消毒过滤离心再生图1．单核中期的小孢子；图2．花药预培4d后，在液体培养基中的小孢子，A,活的；D,死的；图3．分裂成两个细胞的小孢子；图4．分裂成两个营养细胞和两个生殖细胞的小孢子；图5．分裂成4细胞的小孢子；图6．分裂成8细胞的小孢子；图7．分裂成多细胞团；图8．多细胞团从萌发孔突出来，GA,萌发孔；图9．球型胚；图10．细胞从裂开的花粉沟突出来，PD,花粉沟；图11．同时产生球型胚(GE)和愈伤组织（C）；图12．肉眼可见愈伤组织；图13．球型胚又愈伤化；图14．愈伤组织上分化不定芽；图15．发育成小苗。（四）小孢子母细胞培养目的：研究减数分裂和发育，获得单倍体材料。分离困难进行小孢子培养，首先要解决的问题是怎样快速有效地把小孢子从花药中分离出来。对多数作为来说，小孢子分离体系还没有建立起来。油菜小孢子培养：在含有13％蔗糖的液体培养基中进行研磨，洗涤，培养。第三节花药和花粉的培养方法一、材料的选择二、材料的预处理三、培养基四、接种和再生植株培育一、材料的选择1.遗传差异2.母本的生理状态3.花粉的发育时期1.遗传差异（1）种属差异不同物种之间花药培养的反应存在很大的差异。同一属内不同种或品种之间也存在差异。容易诱导：烟草、水稻。不易诱导：郎氏烟草花粉。（2）基因型不同基因型植株的花药对培养的反应不同。

杂种比纯种容易诱导。花粉培养力（愈伤组织的诱导率、分化率、胚状体诱导率、植株诱导率）是受多基因控制的数量性状，因而随着基因型的差异而有很大的变化。2.母本的生理状态早期花蕾（生活力高）、健壮母本。氮素水平（饥饿状态）高纬度、高海拔田间栽培3.花粉的发育时期花粉发育的任何时期都可以经过培养产生愈伤组织或胚状体，花粉发育的过程中，只有某一个时期对离体刺激最敏感。小孢子发育时期：单核早期单核居中期单核靠边期双核期三核期

1.小孢子不同发育时期对胚状体和愈伤组织诱导率不同。2.不同植物种类，诱导胚状体发生和愈伤组织形成，均有其适宜的小孢子发育期对大多数植物来说，单核中期和晚期是诱导花粉胚或愈伤组织的最佳时期，尤其单核靠边期是诱导的关键时刻。举例：玉米：单核中期烟草：单核中期至双核早期

Sunderland(1971)对烟草不同花粉发育时期的培养反应进行了观察：花粉发育时期胚状体诱导频率(％)减数分裂期0单核早期14单核晚期40双核早期55花药在接种以前一般需先用醋酸洋红染色压片镜检，以确定花粉的发育时期，并找出花粉的发育时期与花蕾或幼穗大小、颜色等形态学性状的相关性，便于取材。外观依据花蕾未开放；花蕾长度。在水稻中，以单核靠边期的花粉对诱导单倍体植株较为适宜，在外部形态上可根据叶枕距为5-15cm，颖片淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长度的1/2这些条件鉴定。二、材料的预处理1.低温处理2.高温处理3.离心处理4.激光照射5.乙烯利处理6.甘露醇处理接种前后对花药采用高、低温、高糖等逆境预处理，能使绿苗产量大量增加。逆境预处理促进花粉脱分化和再分化1.低温处理低温预处理是指在接种之前将材料用0℃以上低温处理一段时间后再行接种；低温预处理可以提高花粉胚的诱导。各种植物要求预处理的温度和时间不同。以1-5℃预低温处理小麦幼穗，能提高花粉愈伤组织的产量。在4℃下冷冻石刁柏花蕾，预处理4天、8天和12天，愈伤组织诱导率比室温对照分别提高2.4倍、1.9和1.5倍。

关于低温的作用机理，不同的研究者提出了不同的解释。（1）低温条件下改变了小孢子第一次有丝分裂的轴向，从而促使小孢子发育启动（2）冷处理的作用，在于其能够使绝大多数花粉保持存活并完成诱导过程。但总的看来，其结果多数是小孢子改变原来的发育方向，而转向胚胎发生和孢子体发育2.高温处理引起微管的溶解，使纺锤体解体，导致小孢子核的不正常分裂。培养温度是影响花药反应的一个重要因素。小麦要求先高温培养64天之后，再转入28-30℃下培养。一直高温培养效果并不好。较高的温度虽能诱导较高频率的花粉愈伤组织，但愈伤组织分化白化苗的频率也高。控制培养温度仍是减少白化苗的一个有效措施。3.离心处理单核后期10000-11000r/min，30min原因：花粉孤立；改变轴向4.激光照射促进愈伤组织芽分化5.乙烯利处理1.Bennert:促进花粉细胞核分裂2.王敬驹：形成愈伤组织6.甘露醇处理实验：（1）甘露醇：预培养（2）甘露醇+蔗糖（3）蔗糖原因：造成碳饥饿，维持渗透压三、培养基（一）基本培养基（二）条件培养基（一）基本培养基1.常用的培养基优MS、nitsch、B5、N6等培养基。2.MS培养基用得最广泛。3.禾本类植物N6培养基效果较好。我国科学工作者对水稻、小麦的花药培养基做了改进，研制出N6培养基。在N6培养基上，水稻花粉的出愈率大幅度提高。4.马铃薯提取液为基本成分的马铃薯培养基，现在被广泛地应用于小麦花药培养，效果良好。（1）碳源蔗糖最常用，高浓度利于诱导愈伤组织，抑制花药体细胞增殖。作用：碳源和渗透调节物质。烟草的最适蔗糖浓度为3％，水稻为3％-6％，玉米则为12％-15％。朱至清等(1990)报道在过滤灭菌的条件下，若以0.21mg/L葡萄糖取代液体培养基中同等浓度的蔗糖，小麦花粉胚的诱导频率可增加2-10倍。麦芽糖也有效果。（2）激素往往是必需的，常用细胞分裂素，配合生长素因植物种类差异而选择。一般在禾本科植物中，常用1-5mg/L2,4-D或NAA诱导花粉愈伤组织形成，再将愈伤组织转移至降低或去除生长素或补加细胞分裂素类物质的分化培养基上，以诱导器官分化和再生植株形成。（3）附加成分谷氨酰胺，活性炭等诱导愈伤组织Vc，聚乙烯吡咯烷酮等抗氧化剂防止褐化（二）条件培养基定义：组织培养物产生分泌物进入培养基，使得培养基条件化，成为条件培养基。条件培养基可以促进培养细胞的分裂和分化。花药和子房植物组织在培养的过程中分泌的某些物资对细胞的分裂和生长普遍起作用。四、接种和再生植株培育1.材料的灭菌处理2.培养条件（温度和光照）3.花粉植株的培育4.花粉植株的鉴定5.单倍体植物的染色体加倍1.材料的灭菌处理1）漂白粉2）次氯酸钠3）升汞4）冲洗5）接种：密度2.培养条件（温度和光照）较高的温度：28－30℃不同的植物光照不一样3.花粉植株的培育植株产生方式：花粉胚和愈伤组织诱导（1）花粉胚诱导移栽困难，注意保湿和遮阴（2）愈伤组织诱导

诱导愈伤组织需要注意温度总结影响花粉花药培养的因素1基因型2植株生长条件和生理状态3花粉发育时期4预处理5培养基6培养条件－光照（黑暗条件下，小植株能从花药培养中发育出来。光条件下花药能培养出更多更壮的苗）7花药壁因素4.单倍体的鉴定（1）花粉单倍体植株的鉴定必要性1）体细胞的干扰：花药的结构复杂（药壁、药隔、花丝等体细胞同样具有被诱导成株的可能）2）生殖细胞的自发加倍（2）鉴定方法形态鉴定（形态特征、结实性、花粉粒着色和大小、气孔大小数目）细胞学鉴定（染色体观察）杂交鉴定（自交鉴定、杂交鉴定）分子鉴定（生化标记、分子标记）单倍体植物与它们的二倍体相比较，有三个明显的特点：体细胞染色体数减半；生长发育弱，体形小、各器官明显减小；雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。5.单倍体植物的染色体加倍（1）意义离体条件下，由花粉发育而来的植物，其染色体只有一套，减数分裂不能形成正常配子。故单倍体植物是不育的。对其进行染色体加倍，使其成为可育的二倍体。（2）单倍体植物的染色体加倍方法常用化学诱变剂：秋水仙素；对二氯苯；8-羟基喹啉方法：（1）小苗浸泡法（2）生长锥处理法（3）培养基加倍法方法－化学诱变小苗浸泡－将再生小植株从试管中取出，无菌条件下用秋水仙素直接浸泡，然后再转移至新鲜的培养基中培养。生长锥处理－用秋水仙素水溶液直接浸生长点培养基加倍－将单倍体植株的任何一部分作为外植体，种植在附加一定浓度秋水仙素的培养基中培养一段时间后，转入无秋水仙素的培养基中继续培养。单倍体植株，一旦加倍成功就是一株纯合二倍体，可以正常开花结实，繁殖后代。这样的材料可直接试管繁殖应用于生产，或者作为常规育种的原始材料。花粉培养及单倍体应用存在的问题1.诱导频率低2.体细胞干扰问题3.倍性变异4.白化苗问题植物组织培养技术与花药花粉培养技术的异同点项目相同点不同点植物组织培养技术（狭义）离体的植物组织经脱分化形成愈伤组织，再分化成丛芽，诱导出根，然后进行移栽。外植体为体细胞，染色体数无需加倍花药培养技术取材为花药花粉，培养的为单倍体幼苗，植株弱小，高度不育，必须用秋水仙素处理，使染色体加倍，恢复正常植株的染色体数，而且为纯种第四节单倍体在植物育种中的应用

将具有单套染色体的单倍体植物，经人工染色体加倍，使其成为纯合二倍体。从中选出具有优良性状的个体，直接繁育成新品种；或选出具有单一优良性状的个体，作为杂交育种的原始材料。

单倍体育种的优越性单倍性植物不能结籽，生长势弱，没有单独的利用价值，但其经染色体加倍后成为纯合的双二倍体，因此可缩短育种年限，加快育种进程，在杂交育种、诱变育种、远缘杂交及杂种优势的利用等多方面具有重要意义。1.控制杂种分离缩短育种周期在杂交育种中，由于杂种后代不断分离，要得到一个稳定的品系，一般需要4～6代的时间。再加上品种评比试验等工作，对于一年生植物，要培养出一个稳定的新品种，就需要6～7年甚至8～9年的时间。而对多年生植物，常规方法培养出新品种就需要更长的时间。大大缩短育种周期。2.排除显隐性基因干扰，提高选择效率如果