种子生活力和活力测定

第五章种子生活力和活力测定第五章种子生活力与活力测定本章讲2节§1、种子生活力测定原理及方法§2、种子活力测定原理及方法第一节种子生活力测定的原理与方法在种子贸易中，时常需要在短时间内把握种子批的生活力状况，假设种子处于休眠状态难以通过发芽测定得到结果，种子生活力测定可以满足这一要求。一、种子生活力概念：种子生活力(seedviability)指种子发芽的潜在力量或种胚具有的生命力；种子生活力和发芽具有不同的含义：一些休眠种子在发芽试验中不能发芽，但它是有生活力的，破除休眠后，能长成正常幼苗。而生活力反映的是种子发芽率和休眠种子百分率的总和。所以，种子生活力测定，反映的是种子批的最大发芽潜力。二、种子生活力测定的意义1、测定休眠种子的生活力收获的或在低温贮藏处于休眠状态的种子，正常发芽条件下，其发芽力很低，这种状况下，仅用发芽试验测定其发芽率，就不行能测出种子的最高发芽率。必需进展生活力测定，了解种子的发芽潜力，合理利用种子。〔怎样利用？〕播种之前对发芽率低而生活力高的种子，应进展适当处理后播种。种子检验时，发芽试验末期有颖不发芽的种子或硬实种子，就应接着进展生活力测定；或破除休眠后做发芽试验。2、快速推测种子的发芽力:休眠种子可借助于各种预处理打破休眠，进展发芽试验，但时间较长；而种子贸易中，因时间紧迫，不行能承受标准发芽试验来测定发芽力，由于发芽试验所需的时间较长。如小麦8d，水稻14d，菠菜21d。而多数林木种子则需要更长的时间〔如月季15～25℃发芽，70d计算发芽率〕。这时，可用生物化学法测定种子生活力作为参考；而林木种子可用生活力来代替发芽力。种子生活力测定方法有四唑染色法、靛蓝染色法、红墨水染色法、软X本节将重点介绍四唑染色法，并简要介绍其他方法。三、四唑测定法〔GB〕(一)四唑测定法概述1、进展简史四唑测定法于1942年由德国G.Lakon(莱康)教授制造，二战期间传人美国。ISTA1950年成立四唑测定技术委员会，1953年首次将四唑测定列入国际种子检验规程，主持编写《四唑测定手册》，经过屡次ISTA会议争论修改，于1984年正式公布发行。该手册集合了650多个种属的具体测定技术，是四唑测定的权威性参考书。目前国际和国家检验规程都将其列于正式检验工程，它是测定种子生活力公认的最有效的方法。2、四唑测定方法的特点四唑测定是一种世界公认、省时快速、结果牢靠的种子生活力测定方法。有以下几个特点：原理牢靠，结果准确：主要是按胚的染色图形来推断种子的死与活，该技术已进展成熟。假设能正确使用四唑测定方法，四唑测定3～5％。不受休眠限制：利用种子内部的复原反响显色来推断种子的死与活，不受休眠限制。方法简便，省时快速：所需仪器设备和物品较少〔恒温箱、培育皿、刀片、镊子、放大镜和四唑药品等〕。测定方法也较为简便，一般只需6～24h就能获得结果。特别是同发芽试验相比是很快的。4〕本钱低廉：由于四唑测定所需仪器、物品少和方法简便，所以每个样品测定所花本钱很低。四唑测定也有缺陷：对种子检验员阅历和技能要求较高；结果不能供给休眠的程度。3、适用范围：依据1996国际种子检验规程，四唑测定适用于以下范围：〔p61〕(1)测定深度休眠种子；收获后需马上播种的种子；发芽缓慢的种子；要求估测发芽潜力的种子。另外，也适用于：(2)测定发芽末期未发芽种子的生活力，特别是疑心有休眠时。(3)测定种子收获或加工过程中的种子损伤的缘由(如热害、机械损伤、虫蛀等)。(4)解决发芽试验中存在的问题，如查明不正常幼苗产生的缘由；疑心杀菌剂、种子包衣的处理效果等。(二)、四唑测定法的原理有生活力的种子活细胞内有脱氢酶，可与氧化复原反响指示剂：四唑〔无色〕反响而显色，被复原成为红色、稳定的三苯基甲腊(triphenylformazam)。可依据四唑染成的颜色和部位，区分种子红色的有生活力局部和无色的死亡局部。除了完全染色的有生活力种子和完全不染色的无生活力种子外，还可能消灭一些局部染色的种子。说明在不同部位存在面积大小不同的坏死组织。推断种子有无生活力，主要看胚和胚乳不染色坏死组织的部位及面积大小，而不完全取决于染色的深浅。染色的深浅可以区分强健程度。即染色愈深，种子生活力愈旺盛。四唑染色是一酶促反响，反响不仅受酶活性的影响，还受底物浓度、反响温度、pH(三)、四唑测定法应用的化学试剂1、四唑四唑盐类有多种，常用的是2，3，5—氯化三苯基四氮唑，｛英文2，3，5—triphenyltetrazo1iumchloride｝，缩写为TTC。〔1〕特性①白色或淡黄色粉剂，易溶于水，有微毒，使用时不要接触〔少接触〕。②见光易被复原成粉红色，需用棕色瓶包装，再裹一层黑纸。同样，配好的四唑溶液也应装入棕色瓶里，暗处保存，种子染色也需在暗处和弱光处进展。四唑液浓度常用的四唑染色浓度为0.1％～1.0％(m/v)．一般来说:0.1％～0.5％的四唑溶液；整个胚、整粒种子需用1.0％的四唑溶液。pH:pH要求在6.5～7.5pH不在此范围，反响不能正常进展。因此，对于游离酸含量高的四唑应当用缓冲液配制。即一般国产的四唑游离酸含量高，要用缓冲液配制〔进口的可直接用蒸馏水配制〕。配制方法：称取lg〔或0.1g〕四唑粉剂溶解于100mL磷酸缓冲1.0％〔0.1％〕的四唑溶液；当用酸度计测定时，假设四唑液的 pH值达不到要求，则可用稀NaOH或NaHCO3溶液加以调整。配好的四唑溶液应保存在棕色瓶里，一般有效期可保持数个月。假设存放在冰箱里，有效期更长。2、磷酸缓冲液：其配方如下：ISTA及GB规程法：首先配两种溶液，然后按比例混合即成。溶液I：称取9.078gKH2PO4〔磷酸二氢钾)溶解于l000ml蒸馏9.472gNa2HPO4〔磷酸氢二钠)或11.876gNa2HPO4.2H2O溶解于1000mL蒸馏水之中。然后取溶液I：23以上比较麻烦，也可用北美官方种子检验规程：AOSA规程法：在1000mL蒸馏水中参加5.450gNaH2PO43.790gNa2HPO43、乳酸苯酚透亮液：用于染色后的小粒豆类和牧草种子，经四唑染色后使种皮、稃壳或胚乳变得透亮，以便透过这些局部清楚地观看其胚的染色状况。配法：20mL乳酸＋20mL苯酚(假设苯酚是结晶形式，则需溶化为液体)＋40mL20mL该药液有毒性，在使用时防止触及皮肤或衣服等。配制时最好戴塑胶薄膜手套，并在通风橱里操作。〔四〕、四唑测定法的程序参照 96版《国际种子检验规程》及95GB:1、试验样品：随机数取净种子100粒，2～4次重复〔GB2～4次重复，ISTA4〕2、种子预处理〔预措预湿〕目的：大局部种子在测定前都需经过预处理。目的：使种子加快和充分吸湿，软化种皮，便利样品预备，促进酶的活化，以提高染色的均匀度、鉴定的牢靠性和正确性。由于种子吸湿后，切开、针挑种皮或切开养分组织变得简洁，而干种子则工作困难，并且活细胞内的酶尚未活化，染色效果不良。因此，预措预湿对正确测定是很重要的。预措：指在种子预湿前除去种子外部的附属物。包括剥去果壳和在种子非要害部位弄破种皮。如水稻种子需脱去稃壳；花生剥去果壳；豆科硬实种子需刺破种皮等。留意：预措不能损伤种子内部胚的主要构造。而大多数种子则不需预措处理。预湿：是四唑染色测定的必要步骤。由于吸账种子一般比干种子不易裂开，比较简洁切开或刺破种皮。目前常用预湿方法有二种：①缓慢吸湿：将种子放在纸上或纸间吸湿。适用于：直接浸在水中简洁裂开的种子；已经劣变的种子〔陈种子〕；过分枯燥的种子。缓慢吸湿，能较好地解决吸湿和供氧的冲突。GB规定：像大豆、菜豆、葱、花生等种子要求缓慢纸床预湿。禾谷类种子既可水浸预湿，也可缓慢纸床预湿。缓慢预湿可承受下面两种方法：a纸床上预湿：小粒豆类种子，如苜蓿、三叶草等种子。b纸卷或纸间预湿：像大豆、菜豆、豌豆等种子。②快速水浸预湿：将种子完全浸入水中，充分吸胀。由于种子直接浸入水中，吸水快、吸水均匀，可缩短预湿时间。适用于种子直接浸入水中，不会造成组织裂开的种子。包括水稻、麦类、玉米等。浸种温度一般承受20℃～30℃水温。具体种类和浸种时间见《农作物种子四唑染色技术规定》。3、染色前的种子处理种子在染色前需将胚的主要构造和活的养分组织暴露出来，利于四唑溶液渗透，便于正确鉴定。〔p63图5－1〕说明种子不同切法的部位，常见的有以下几种：不须样品预备：a、种皮渗水性良好的小粒豆类种子〔如紫花苜蓿和小扁豆等〕，染色时就能随着四唑溶液的渗入而吸胀，并在染色后剥去种皮就可正确鉴定。这类种子不须样品预备。b、大粒豆类：可承受缓慢吸湿后不须样品预备。〔如菜豆和大豆等〕但在染色后观看鉴定前也需剥去种皮，以便鉴定更为牢靠。〔2〕沿胚纵切取半粒：适用于具有直立胚的大粒禾本科种子。如玉米、麦类和水稻等种子。方法：沿胚纵切，使胚的主要构造暴露出来，取其一半用于染色观看。〔3〕剥去种皮：棉花、十字花科种子需剥去种皮或内膜；瓜类也剥去种皮。方法是：将预湿后的整个种皮剥去。4、四唑染色将处理好的种子放在小烧杯内，然后参加适宜浓度的四唑溶液，以漂浮种子为度，移至肯定温度的黑暗恒温箱内进展染色反响。染色时间：因种子种类、样品预备方法、生活力的强弱、四唑溶液浓度、pH值和温度等因素的不同而有差异，其中温度影响最大。在20～45℃5℃，其染色时间可削减一半。例如：30℃适宜染色时间为6h，35℃3h，40℃1.5h35℃35℃染色：玉米、麦类等禾谷类种子0.5～1h3～4h剥去种皮染色的种子2～3h具体见《农作物种子四唑染色技术》。到达规定时间或染色已很明显时，倒去四唑液，用水冲洗。假设到达规定时间种子染色仍不够完全，可适当延长染色时间。5、鉴定前处理书上简单不进展处理的种子，观看前要适当处理使胚部暴露出来，具体处理方法规程中都有：〔p201-204〕如一些小粒豆类、棉籽沿胚中轴纵切；瓜类除去种皮和内膜；大粒豆类〔大豆、菜豆、花生〕：除去种皮，掰开子叶，露出胚芽。大粒种子可直接用肉眼或放大镜观看；小粒种子最好用10～100倍体视镜观看。6、观看鉴定测定结果的牢靠性取决于检验人员对染色组织和部位的正确识别、工作阅历等综合运用力量。观看鉴定的主要目的是区分有生活力和无生活力种子。一般鉴定原则：a、但凡胚的主要构造染成鲜红色，为有生活力种子。b、但凡胚的主要构造局部不染色，不染色局部超过允许范围，为不正常种子。c、但凡完全不染色的为死种子。不正常种子和死种子均作为无生活力种子。观看的部位：①禾谷类：主要观看胚芽、胚轴、胚根、盾片。鉴别标准：除完全染色的为有生活力种子外，以下有残缺的种子也有生活力：a、盾片上部或下部任一端不染色的局部＜1/3b、胚根的顶端：玉米1/3不染色；水稻、高粱2/3不染色；麦类大局部不染色，但不定根的原始体须染色。理解：胚芽必需染色，胚根不染色可以长出次生根。②豆类：有生活力的种子允许不染色的最大面积：a、胚根顶端不染色：花生为1/3；蚕豆为2/3；其他为1/2.b、子叶顶端不染色：花生为1/4；蚕豆为1/3；其他为1/2.c1/4，蚕豆除外。1/2；子叶顶端不染色允许1/2。〔胚芽必需染色〕④其他种属：〔棉属、芸苔属等〕1/3子叶顶端1/3不染色。〔胚芽必需染色〕P70图5－2小麦种子四唑测定结果的鉴定标准〔单子叶〕：图中黑色局部表示染成红色，有生活力组织，白色局部表示不染色的死组织。1－6有发芽力：1．整个胚染成鲜红色；2～5．盾片末端不染色；胚根尖端不染色；7－16胚根3/4以上不染色8．胚芽不染色；〔一点也不行〕9．盾10．胚轴不染色；11．盾片末端和胚芽尖端不染色;12．胚的上半部不染色；13．盾片不染色；14．盾片、胚根和胚根鞘不染色；15．染成模16．整个胚不染色。图5-3大豆种子四唑测定结果的鉴定结果标准1－31．胚染成鲜红色；仅子叶远离胚芽局部少量未染色;仅子叶下部和边缘少许不染色；4－6子叶上部重要部位未染色；〔面积少也不行〕5．胚根主要部位不染色；6．子叶一半以上未染色。1农作物种子四唑染色技术规定7、结果计算与处理依据样品胚部的显色状况，分别计算各重复有生活力种子的百分率。GB/T3543.7-1995对试验样品的规定至少200粒：即2～4次重复。查重复间的最大允许差距:X1X2X3X4→求平均数X〔GB：但生活力有二、三次重复值；而发芽试验无二、三次重复值〕XX≤容许差距结果正确用X表示。【例】测某种子生活力，三次重复95％、96％、98％。X＝96.3％；98－95＝37。95％、99％。X＝97％99－95＝4＜容许差距6。〔五〕留意事项：纵切禾谷类种胚时，肯定要沿胚中部纵切，使切面显示胚的各局部构造，否则会消灭鉴定误差。1、假设切面不正假设保存大的：胚芽是完整的，染色时间短，胚芽可能不染色。其他地方染色均匀，也属正常有生活力的种子。假设保存小的：胚芽与盾片有缝，只要其他局部染色深、均匀，也有生活力。2、切面粗糙：切时剥开，局部细胞被撕开，细胞被破坏，表层细胞不染色。所以切面要光滑。这时染成乳白色与不染色是有区分的。〔p71离体胚培育法:主要测定发芽缓慢或休眠期长的种子生活力，主要用于林木种子，农作物种子用的少。〕四、染料染色法〔GB中无，了解〕同p73(一)测定原理〔TTC法：活细胞染成红色；本法相反：活细胞不染色〕有生活力的种子，其活细胞原生质膜具有选择透性，当种子浸入染料后，染料大分子不能进入活细胞内，其胚部活组织不能被染料染色；而死的种胚原生质膜丧失选择吸取力量，故可被染料染色。(二)测定方法1、靛蓝染色法适用于豆类、谷类、棉花、瓜类和林木等大粒种子的生活力测定。试剂为靛蓝：蓝色粉剂，能缓慢溶于水。测定方法如下：(1)种子预处理：〔100×2〕先将种子去壳，浸入30℃水中，充分吸账。浸种时间：小麦、大麦、大豆、豌豆和向日葵等为3h，4h6h，蓖麻、红麻、大麻等7h；黍8h；水稻12h；玉米20h。然后，禾谷类沿胚中线纵切；双子叶种子剥去种皮，以备染色用。靛蓝染色：将处理好的种子置于小烧杯内，参加靛蓝溶液漂浮种子。浓度：纵切种子用0.1％溶液，剥去种皮种子用0.2％溶液。15min，油菜、芝麻、红麻和大麻等30min，大豆、亚麻、向日葵、蓖麻、花生和棉籽等60min，3h。观看鉴定：取出种子，用清水冲洗后马上进展观看鉴定。凡种胚不染色或染成浅蓝色的、胚根尖端或少局部子叶染色的，为有生活力种子；凡种胚全部染成蓝色的，或胚根、胚轴、胚芽、子叶等大局部染成蓝色的，为无生活力种子。2．红墨水染色法测定原理、种子预处理、染色时间等与靛蓝染色法根本一样。不同点：染成的颜色不同，死胚染成红色，活种子胚不染色。测定时用刚开瓶的红墨水，红墨水与水的比例：小麦、玉米、大豆和棉花等为1：60；大麦以1：120为宜。到达规定染色时间后取出种子，用清水冲洗，马上鉴定。五、软X〔检验员读本无〕《1996国际种子检验规程》增加了X射线测定技术，国内没列入国标〔93〕。软X0.0l～0.05nm，穿透力弱。〔机械工业部〕湘西探伤厂产的HY-35型农用X光机。主要用于：作物种子成熟度的观看〔水稻、花生〕种子隐蔽害虫的检验〔进口林木种子隐蔽害虫〕农作物种子生活力测定〔软X射线渗钡造影法〕(一)测定原理活细胞的原生质膜具有选择透性，而死伤组织丧失选择透性。用氯化钡〔BaCl2〕溶液浸种渗透后：凡有生活力的种子不吸取钡〔Ba＋＋〕离子；无生活力的种子钡〔Ba＋＋〕就会渗入种子细胞内部。软X射线造影时，由于重金属离子能猛烈吸取x射线：把这种渗钡状况不同的种子置于软X光机曝光造影：在荧光屏上〔印成相片后〕：死伤组织，渗入钡离子吸取了X射线，较为黑暗；活种子较为光明。在底片上相反：死组织较透亮；而活组织较为黑暗。(二)测定方法种子预湿随机数取净种子200粒，每重复50粒。在室温下清水中浸泡2～16h充分吸账；对直接浸水简洁裂开的种，可先进展缓慢预湿后再浸16h，然后取出种子用滤纸吸去种子外表的水分。造影剂处理凡不能透过活细胞的半透膜，而又能渗入死细胞内部的重金属盐类，均可作为造影剂。常用的造影剂是BaCl2:造影效果好；价格廉价；使用便利。将预湿好的种子放入20％的BaC12溶液中，处理时间一般为1～2h。〔玉米粒大为2.5h1.5h1h〕。留意：应严格把握BaC12浸种时间，过长、过短都会影响测定的正确性。将种子取出放入网兜，用自来水冲洗，再用吸水纸吸干种子外表的水分，60～70℃1h。软x射线摄影:可进展透视摄影；或荧光观看〔仅限于大粒种子〕。我国主要应用Hy—35型农用x光机。曝光条件：电压〔kv〕=30千伏，电流〔mA〕=3毫安。2040照耀剂量和透过率太大，反差不明显，影像不清楚。照耀剂量太少，不同厚度的组织均不能通过，没有产生造影效果。因此，必需在实际测定中确定最正确摄影条件。常用胶片有：国产8DIN〔定〕黑白片，经济适用、可放大，可印相。X也可用4号相纸〔GB21〕直接印相，可供自己看。摄影时，在暗室内剪取适当大小的胶片，装入黑纸袋内，置于摄影台上，将种子放在黑纸袋上排好摄影。影像鉴定在暗室用D-72显影液显影和酸性定影液定影。鉴定原则：在照片上〔荧光屏上〕：种胚黑色的，为无生活力种子；种胚白色的，为有生活力种子。在胶片上〔底片上〕：种胚透亮的，为无生活力种子；种胚黑色的，为有生活力种子。总之，软x射线造影技术具有多方面的用途：①既能测定种子生活力，不受种子休眠限制。与四唑相比，具有不破坏性样品的优点。②也能观看种子内部害虫和机械损伤，区分饱满与空瘪、虫蛀等。r=0.995.特别适用于：番茄、西瓜和黄瓜等扁平种子生活力分析。本节重点：种子生活力的概念；四唑染色技术的原理。其次节种子活力测定原理及方法种子活力〔seedvigor〕是种子质量的重要指标之一，与种子田间出苗质量亲热相关。活力测定经过几十年的争论，已取得了重大进展。在美国和欧洲，很多种子公司把活力测定作为常规的检验工程，但国内没被列于国标。一、种子活力的概念种子活力的定义长期得不到统一，不同学者有不同的定义，经过271977ISTAp751、种子活力是打算种子或种子批在发芽和出苗期间的活性水平和行为的那些种子特性的综合表现。表现好的为高活力种子，表现差的为低活力种子。北美官方种子分析家协