烟雾暴露所致肺气肿小鼠模型的建立与评价

烟雾暴露所致肺气肿小鼠模型的建立与评价曹君;陈平;杨悦;欧阳若芸;彭红【摘要】目的探讨单纯烟雾暴露所致肺气肿小鼠模型建立及病理学、气道炎症及肺功能评价,并进行支气管肺泡灌洗(bronchoalveolarlavage,BAL)技术的改进.方20C57BL/6J90d30dBALF(Raw)较正常对照组增高,动态肺顺应性(Cdyn)降低;BALF中细胞总数高于正常对照组,巨噬细胞数(AM)、中性粒细胞数(N%)也高于对照组,差异均有统计学意义;病理学观察示烟雾暴露组肺泡腔扩大、部分肺泡间隔断裂、肺泡腔融合、肺气肿形成,气道上皮排列紊乱、部分气道上皮增生、周围炎症细胞浸润并伴有平滑肌增生;形态学计量分析示烟雾暴露组平均内衬间隔(MLI)及肺泡破坏指数(DI)较正常对照组增加.应用改进技术行BAL成功率100%,回收率高达90%.结论单纯烟雾暴露可以成功建立小鼠肺气肿模型且稳定可靠,与人类慢性阻塞性肺病相似性好,经BAL技术改进后该模型可行性高.【期刊名称】《中国实验动物学报》【年(卷),期】2010(018)004【总页数】6页(P278-282,后插2)【关键词】慢性阻塞性肺疾病;肺气肿;香烟烟雾;动物模型;支气管肺泡灌洗【作者】曹君;陈平;杨悦;欧阳若芸;彭红【作者单位】中南大学湘雅二医院呼吸内科,长沙,410011;中南大学湘雅二医院呼吸内科,长沙,410011;中南大学湘雅二医院呼吸内科,长沙,410011;中南大学湘雅二医院呼吸内科,长沙,410011;中南大学湘雅二医院呼吸内科,长沙,410011【正文语种】中文【中图分类】R-563.3;R-332慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease，COPD)由于其患病人数多，死亡率高，社会经济负担重，已成为一个重要的公共卫生问题［1］。阻COPDCOPD鼠模型［2，3］，而关于小鼠肺气肿模型建立研究很少，但国外小鼠肺气肿模型小鼠有易于饲养，繁殖能力强及实验费用低等优点;且与人类同源性高，是一种很好的研究人类疾病的动物模型。支气管肺泡灌洗(bronchoalveolarlavage，BAL)是COPD动物模型研究中重要部分，获取的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid，BALF)可通过计数炎症细胞、检测细胞因子水平等反映肺局部病理及生理变化。实验材料及仪器芙蓉牌香烟(焦油13毫克/支，湖南中烟工业有限责任公司)，CarlZeissAxioskop40光学显微镜(德国CarlZeiss公司)，静脉留置针(直型，22G，威海洁瑞医用制品有限公司)，PLY3211小动物肺功能检测系统(美国BuxcoElectronics公司)。动物分组6周龄SPF级近交系C57BL/6J雄性小鼠20只，体重18～20g，来源于中国科学院上海实验动物中心【SCXK(沪)2007－0005】，于中南大学湘雅二医院实验动物中心清洁房饲养，温度21～23℃，湿度50%～60%，昼夜12h节律，自由进食、饮水。小鼠随机分为正常对照组及烟雾暴露组，每组10只。实验过程中按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。肺气肿模型建立小鼠适应性饲养两周后开始造模。采用自制的有机玻璃箱(69cm×47cm×38cm)，玻璃箱1/2高度处置有机玻璃隔板(隔板上有直径1cm圆形通风孔，排布密度:1个/6cm2)将玻璃箱分为上下两部分，有机玻璃箱顶及四侧面下1/2均有圆形通气孔(箱顶:1个/100cm2;侧面下1/2:1个/250cm2)。将10只C57BL/6J小鼠置于隔板上，于玻璃箱下1/2空间内点燃615min5min，重复一次烟雾暴露。每日两次上述烟雾暴露，连续90d，停止烟雾暴露后观察30d。正常对照组小鼠亦同时放入另一自制有机玻璃箱中，呼吸空气。为初步观察烟雾暴露过程中肺病理变化，在烟雾暴露过程中第3090d小鼠肺功能检测30d，10%水合氯醛(3mL/kg)腹腔麻醉小鼠，固定，备皮、消毒管并连接小动物肺功能仪进行肺功能测定，记录气道阻力(Raw)、动态肺顺应性(Cdyn)及呼气峰流速(PEF)等指标。描记一段平静呼吸后，于呼气末自接口处快速1.0mL支气管肺泡灌洗液的收集及计数肺功能测定后颈椎脱臼处死小鼠，打开左侧胸腔，沿肺叶向上分离结扎左主支气管;自气管切开处置入22G静脉留置针套管并结扎气管，静脉留置针尾接1mL注射PBS0.5mLBALPBS90%～92BALF20μLBALF4℃1000r/min10min，取PBS3，Wright－Giemsa小鼠肺组织病理学观察及形态定量分析结扎右侧主支气管及左上肺支气管并注入4%多聚甲醛至左下肺膨胀，随后将左下肺浸入4%多聚甲醛中固定24h，石蜡包埋、4μm连续切片，常规苏木素－伊红(HE)染色，光学显微镜观察HE染色。平均内衬间隔(meanlinearintercept，MLI)测定:每只小鼠取3个HE染色切片，低倍镜(×100)下随机取5个视野(避开大血管和支气管)，在每个视野正中心划十字交叉线，计数与交叉线相交的肺泡隔数(NS)，同时测出十字线总长(L)，按公式计算:MLI=L/NS，以表示肺泡平均内径。肺泡破坏指数(Destructiveindex，DI)的测定参照陈燕等［4］方法进行:每只小鼠取3个HE染色切片，每张切片低倍镜(×100)下至少观察20个非重复视野，分别以正常(N)或破坏(D)记录肺泡结构的破坏情况，要求每一例各切片的N、D值总和≥3000，以公式计算DI=D/(D+N)×100。统计学处理计量资料均以(±s)表示，采用SPSS13.0统计软件包进行统计学处理，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。小鼠一般情况观察两组小鼠在实验前外观、对刺激的反应及体重均无明显差异。实验中烟雾暴露组小鼠在早期表现燥狂不安，随烟雾暴露时间延长而转为安静。在烟雾暴露后期，小鼠出现进食减少，行动迟缓，毛发干涩无光泽。烟雾暴露过程中无小鼠死亡。正常对照组小鼠饮食正常，活动灵敏，皮毛有光泽。小鼠肺功能检测1－C)下半部分为吸气相，上半部分为呼气相。与正常1－A1－B)流量－时间曲线的上半部分上升支较Raw对照组增高明显，CdynP0.05);烟雾暴露组呼气峰流速(PEF1。BALFBALA90BALF±1.0)%、(90.5±1.3)%，BALFBALF(AM)、中性粒细胞数(N%(P0.052。小鼠肺组织病理学改变及形态定量分析正常对照组在各时间点肺组织病理无明显变化。与正常对照组小鼠比较(图2－A)，烟雾暴露30d时小鼠肺组织可见炎症细胞浸润、部分肺泡腔轻度扩大(图2－B);至第90天时出现明显肺泡腔扩大、肺泡壁变薄、肺泡间隔破裂及肺泡腔融合，肺气肿形成(图2－C);停止烟雾暴露30d，亦可见明显肺泡腔扩大及融合(图2－D)。停止烟雾暴露30d，比较正常对照组及烟雾暴露组平均内衬间隔(MLI)及肺泡破坏指数(DI)，可见烟雾暴露组小鼠肺组织MLI及DI均较正常对照组高，差异有统计学意义(P均＜0.05)。见表3。图2见彩插2。观察两组小气道病理表现，可见正常对照组小鼠气道壁结构清楚，气道上皮排列整齐，未见明显上皮脱落(图3－A)。而烟雾暴露组小鼠气道上皮排列紊乱、部分脱落、局部气道上皮增生(箭头E所示)、管壁增厚、管腔变小;气道周围大量炎症细胞浸润(箭头I所示)、部分气道周围肺泡等支撑结构缺失(箭头S所示)并伴有局部平滑肌增生(箭头SM所示)(图3－B，图3－C)。图3见彩插2。COPDCOPDCOPD动物模型应满足以下条件:(1COPD;(2)必须有气流阻塞存在，小气道阻力增高，Cdyn(3)气道重塑/建;(4)可伴有气道高反COPD究已成为肺气肿研究领域中的热点。我们既往研究［6，7］采用烟雾暴露成功建COPDSD4SDWistarSD99%的基因存在于小鼠，93%的小鼠C57BL/6JMarch等［8］研究发现就吸烟诱导的肺气肿而言，B6C3F1小鼠较F344大鼠更敏感。Nikula等［9］研究表明吸烟所致小鼠模型是一种可靠的肺气肿动物模型。Yao［10］C57BL/6J、A/JAKR/J、CD－1129SvJC57BL/6JValenca［11］将C57BL/63/次，3/日，60d见肺气肿样改变，伴肺泡巨噬细胞增多、细胞外基质改变及MMP－12表达增加。VanderStrate［12］C57BL/6J，2/日，2/次，10/5d4而增加;同时烟熏小鼠肺组织有与人类肺气肿相似的随肺气肿进行性增加的B淋巴细胞滤泡。由此可见，烟雾暴露所致肺气肿C57BL/6J小鼠肺内存在与人类相似的病理生理改变，但上述研究均未对烟雾暴露停止后肺病理变化进行观察，且较少应用肺功能对模型可靠性进行评价。本研究采用自制烟雾暴露箱对C57BL/6J小鼠进行全身香烟烟雾暴露，6支/次，4次/日，连续90d，建立肺气肿小鼠模型，造模时间与国外研究［11，12］不一致，考虑与香烟种类、烟雾暴露方式、烟雾浓度、暴露时间及暴露频度有关。在造模过程无小鼠死亡，说明该方法安全性好。肺功能是评价肺气肿模型建立的重要评价标准之一，本研究采用国际公认的BUXCO呼气部分曲线上升支陡直，提示肺组织弹性较差;而后下降缓慢并伴有顿挫，呼气相延长提示小气道存在阻塞，呼出气流不畅。进一步肺功能数据分析显示:烟雾暴RawCdynCOPDBALFBALF增加为主，提示烟雾暴露可致肺局部炎症细胞的聚集，继而活化释放一系列炎症因子、趋化因子、氧自由基与蛋白酶等，导致炎症反应及蛋白酶/抗蛋白酶失衡等一系列病理生理过程，参与肺气肿形成。本研究亦初步观察了两组不同时间点肺组织病理改变，发现正常对照组小鼠各时间点肺部病理表现未见明显差异，无自发性肺气肿形成，与进一步论证该小鼠用于建立实验性肺气肿模型的可行性。而烟雾暴露组烟雾暴露第30天时小鼠肺组织即有9030d，发现小鼠肺组织肺气肿程度未见减轻，似乎有COPD结构缺失及平滑肌增生，提示烟雾暴露组存在气道重塑，与人类COPD表现一致。上述肺功能、气道炎症及病理学评价指标证实该C57BL/6J小鼠肺气肿模型建立成功，符合人类COPD改变，且稳定性较好。BAL成功率高。具体做法是:轻柔暴露气管后，丝线置于气管下备用，持静脉留置针自0.4～0.8cm，结扎1.0mLBALBALBALBAL，操作简单，无需完整分离双肺及10090%～92%;但该方法使用的直型静脉留置针成本较普通注射器高，不可高压消毒以重复利用，如实验不要求无菌则可清洗干净后重复使用。本研究结果显示，烟雾暴露90d可致C57BL/6J肺泡腔扩大及融合、肺气肿形成，停止烟雾暴露后肺部病理改变不会减轻，且肺功C57BL/6JCOPDCOPD病机制及寻找有效治疗方法提供了一个非常好途径。(本文图2，3见彩插2。)【相关文献】［1］中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2007年修订版)［J］.中华结核和呼吸杂志，2007，30:8－17.［2］陈剑波，陈平，蔡珊，等.烟雾暴露慢性阻塞性肺疾病大鼠肺内细胞凋亡和增殖的变化［中华结核和呼吸杂志，2007，30(9):709－710.［3］陈劲龙，冉丕鑫.血管内皮生长因子与烟雾暴露所致大鼠肺气肿发病关系的研究［J］.中华结核和呼吸杂志，2003，26:671－674.［4］ChenY，HanaokaM，ChenP，etal.Protectiveeffectofberaprostsodium，astableprostacyclinanalog，inthedevelopmentofcigarettesmokeextract－inducedemphysema［J］.AmJPhysiolLungCellMolPhysiol，2009，296:L648－656.［5］郑鸿翱，何韶.建立慢性阻塞性肺疾病动物模型方法的研究进展［J］.中国实验动物学报，2003，11(4):249－252.［6］ZhangC，CaiS，ChenP，etal.Inhibition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