生物技术9课时汇总实验一基因组dna制备

分子生物学技术周倜

中山医学院生化教研室学习要求掌握的主要内容核酸技术（提取，纯化，鉴定）蛋白质技术（提取，纯化，鉴定）其他基本要求离心技术，电泳技术，分光光度技术加样，染色，各种试剂的使用实验室秩序（时间，物品保管，工作服，分组与值日）仪器与设备的使用实验室安全环保实验室管理与操作规程本次实验安排口腔粘膜基因组DNA的提取与纯化实验原理1、核酸的分类DNA

主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。

RNA

存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。在细胞中核酸都是以与蛋白质结合的状态存在。染色体染色质纤维核小体组蛋白DNA核酸提取的主要步骤主要包括：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质及多糖、脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子、去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化核酸等。人基因组DNA的制备实验目的及意义

1.从人口腔上皮细胞中提取纯的基因组DNA2.掌握基因组DNA抽提的方法，理解核酸分离纯化的基本原理

实验材料及试剂材料：人口腔上皮细胞试剂及其功能：抽提缓冲液：Tris-ClpH8.0，EDTA，NaCl，RNAaseSDS，蛋白酶K，饱和酚氯仿/异戊醇（24:1）

75%及95%乙醇

TE缓冲液：Tris，EDTA

基因组DNA提取原理

利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，可用玻璃棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。

分离纯化基因组DNA的方法有很多种：不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，分离方法也有差异。但原理相似，都是利用两种DNA的差异来分离的，因此它们有共同的步骤：

①裂解细胞：SDS裂解细胞，EDTA抑制核酸酶

②除去蛋白质：蛋白酶K水解蛋白质，酚和氯仿/异戊醇抽提、分离蛋白质；③析出DNA：乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。取材:漱口后(去食屑)，含生理盐水10~15ml约2~3min(偶尔咀嚼)，用15ml离心管离心①（4000rpm10min）收集细胞，弃上清

沉淀中加入0.5ml抽提缓冲液，重悬沉淀，转移至1.5mlEP管

（微量移液器的正确使用）混匀，65℃温育15min，间歇振荡

加入等体积的饱和酚（注意：取下层的酚溶液），充分颠倒混匀②

12000rpm5min，上层水相转移至新的EP管

（高速离心机的使用与安全：管对称平衡）

加入等体积氯仿/异戊醇，颠倒混匀③

12000rpm5min，上层水相转移到新的EP管

加入2倍体积95%的乙醇，颠倒混匀，12000rpm5min④弃上清，沉淀中加入0.5ml75%乙醇漂洗，12000rpm2min⑤

轻轻弃去上清，打开EP盖，管平放室温静置10~15min

加入30lTE溶液，4℃保存，便于下次实验电泳染色检测和PCR

实验操作分离纯化核酸总的原则：

①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染（蛋白质、脂类、糖、有机溶剂、金属离子、外源DNA、RNA等）

。核酸纯化应达到的要求：

①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子的污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。2、核酸制备的一般原则①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。②减少化学因素对核酸的降解（如过量酸碱）

。③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力（强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融）和高温④防止核酸的生物降解（核酸酶的预防）

。

3、核酸制备时应注意的事项:核酸制备的步骤：破碎细胞提取纯化I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质

V.核酸溶解在适量缓冲液或水中apoB(用个人基因组DNA为模板）混合液引物12.5

μl2ulDNA模板dH2O24μl6.5ul总体积：25μl

94℃5min（预变性）

94℃1min（变性）

60℃4min退火+延伸（30个循环）

60℃5min（续延伸）

4℃保存PCR加样表PCR程序关于apoB基因独立于2号染色体短臂末端，编码apoB蛋白质全长43kb(28个内含子，29个外显子）apoB基因DNA多态性或遗传变异高胆固醇血症、动脉粥样硬化、心梗、冠心病、肥胖apoB基因只要有微小变异（缺陷）都可以引起高胆固醇和高甘油三酯血症1．简要叙述酚/氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因。沉淀ＤＮＡ时为什么要用无水乙醇？4、问题与讨论微量加样枪使用程序及注意事项

分子医学实验室1每次实验课前主管技术员检查确认加样枪完好后交带教老师签名领取。2带教老师检查确认加样枪完好后按编号交各组学生使用。3学生使用完后按编号交回带教老师。4带教老师确认加样枪完好后交主管技术员检查签收。微量加样枪使用程序第一步:看整体操作按钮容量刻度套头操作按钮容量刻度套头第二步:看大小调节加样枪容量时切勿超过最大容量，否则加样枪将被损坏。20l1000l100l100100200调节加样枪容量时切勿超过最大容量，否则加样枪将被损坏

0.5--10l20--200l100--1000l10.020