第四五章噬菌体载体及粘粒及目的基因的准备重组及重组子的鉴定详解演示文稿

第四五章噬菌体载体及粘粒及目的基因的准备重组及重组子的鉴定详解演示文稿第一页，共三十六页。优选第四五章噬菌体载体及粘粒及目的基因的准备重组及重组子的鉴定第二页，共三十六页。第三页，共三十六页。第四页，共三十六页。三、噬菌体的体外包装*重组体DNA分子的转染(transfection)作用105~106噬菌斑/gDNA*体外包装转导(transduction)第五页，共三十六页。天然包装过程第六页，共三十六页。体外包装过程尾部突变-头头部突变-尾E-72%E--累积尾部蛋白D-与DNA进入头部及头部成熟有关D--累积头部蛋白第七页，共三十六页。四、凯伦噬菌体载体(charon)两类特点：酶切位点多、含LacZ、容量大克隆程序:分离线性噬菌体DNA-酶切分离左右臂+中央区段-与外源DNA混合-包装几kb~23kb噬菌体载体及派生载体的优点：感染效率高第八页，共三十六页。五、柯斯质粒载体1、柯斯质粒载体的构建定义：(cossite-carryingplasmid)eg.pHC79(+pBR322)cos+与噬菌体包装有关的序列ori+Ampr+Tetr容量：31~45kb第九页，共三十六页。第十页，共三十六页。2、柯斯质粒载体的特点*具有噬菌体的特性（环化）*具有质粒载体的特性*高容量3、柯斯克隆优点：容量大、非重组体少问题：分子内重组成多聚体（碱性磷酸酶处理）基因间连接（电泳分级分离）第十一页，共三十六页。第十二页，共三十六页。六、单链DNA噬菌体载体*M13、f1、fd*优点：双链复制型、单双链均可转染宿主、颗粒大小受DNA多寡制约、易测出插入方向*M13克隆体系特性：LacZ、诱导及组成型的LacZ、成对构建（M13mp8、M13mp9）

第十三页，共三十六页。第十四页，共三十六页。七、噬菌体展示载体(phagedisplay)丝状噬菌体（M13/fd)表面-3~5拷贝geneIII产物-颗粒组装及F性须吸附G.P.Smith-1985建立-在噬菌体表面表达蛋白应用：噬菌体表面展示文库*原理*分离hGH变体第十五页，共三十六页。第十六页，共三十六页。第十七页，共三十六页。第十八页，共三十六页。八、噬菌粒载体(phasmid)M13类的缺陷：-插入后遗传稳定性下降，且与片段大小有关-实际上总以正向插入-容量有限（1500bp）改进的M13类-噬菌粒-分子小：3kb-容量10kb-双向性（细菌质粒和phage）第十九页，共三十六页。第二十页，共三十六页。T3+T7第二十一页，共三十六页。1、噬菌体载体的类型及其比较。2、噬菌体的体外包装原理。3、什么是凯伦噬菌体载体？有怎样的特点？4、什么是柯斯质粒载体？有怎样的特点？5、单链DNA噬菌体载体的优点。6、噬菌体展示载体的工作原理。7、噬菌粒载体的特点。复习提纲第二十二页，共三十六页。第五章目的基因的准备、重组及重组子的鉴定一、cDNA基因文库的构建（汇集生物体所有cDNA序列的重组DNA群体）1、cDNA基因文库的优点：病毒RNA筛选简单表达测定基因结构（内含子外显子）、时间调节基因表达特征分析2、缺点：无调节序列低丰度mRNA克隆难第二十三页，共三十六页。

Clerke&Carbon公式：N=ln(1-p)/ln(1-f/g)特异mRNA拷贝数/总mRNA种类可克隆片段大小/基因组总长度mRNA丰度克隆基因的大小(载体容量)10670/29%=87000N=ln(1-99%)/ln(1-1/87000)=1.7x105第二十四页，共三十六页。3、RNA的制备及纯化总RNA的提取mRNA的纯化-oligodT-纤维素柱层析特异mRNA的富集（mRNA分级分离、蔗糖密度梯度离心）特异mRNA的分析鉴定*mRNA体外翻译（麦胚、兔网织红细胞）*RNA电泳-NorthernBlot第二十五页，共三十六页。4、cDNA两链的合成5、双链cDNA分子与载体的连接*同聚物加尾*linker-连接子6、重组体导入宿主转化、转染、电脉冲第二十六页，共三十六页。RNaseH方法第二十七页，共三十六页。Self-priming第二十八页，共三十六页。同聚物加尾第二十九页，共三十六页。重组-linker第三十页，共三十六页。二、cDNA基因文库的筛选与特异重组体的鉴定1、遗传检测*利用载体提供的表型特征*插入基因功能表达2、物理检测*凝胶电泳第三十一页，共三十六页。3、核酸探针（screeningalibrary)第三十二页，共三十六页。4、免疫化学检测*标记抗体探针*免疫沉淀5、转译筛选法*杂交抑制的转译-丰富mRNA*杂交选择的转译-低丰度mRNA-insulin6、正负筛选法组织特异性、发育阶段特异性、特殊处理后基因表达差异第三十三页，共三十六页。第三十四页，共三十六页。三、基因组DNA文库的构建与筛选1、基因组DNA文库：汇集生物体所有DNA序列的重组DNA群体2、目的研究结构基因及其调控序列基因组结构3、目的基因的准备*限制酶切法-鸟枪法(shot-gu