临床检验技师-临床血液学检验(2019)讲义第二十章-血栓与止血检验的基本方法

第第页共14页常人混合血浆与乏因子血浆混合，测定APTT,作出标准曲线。从各自的标准曲线中分别计算出受检血浆中FW：C、FIX：C、FXI：C和FXn：C相当于正常人的百分率（％）。（2）临床意义1）增高：主要见于血栓前状态和血栓性疾病，如静脉血栓形成、肺栓塞、妊娠高血压疾病、晚期妊娠、口服避孕药、肾病综合征、恶性肿瘤等。2）减低：FW：C减低见于血友病A、血管性血友病、血中存在因子W抗体、DIC；FIX：C减低见于血友病B、肝脏病、维生素K缺乏症、DIC、口服抗凝药物；FXI：C减低见于因子XI缺乏症、肝脏疾病、DIC等；FX：C减低见于先天性因子XX缺乏症、肝脏疾病、DIC和某些血栓性疾病等。（3）注意事项FW：C：在严重肝实质损伤时，FW：C可明显升高。FW：C减低时，需与vWF含量同时测定，以筛选出vWF缺陷的可能。2）目前认为，凝血因子促凝活性测定不必等待逐级筛选和纠正试验的结果，可以在单纯APTT延长时检测。3）受检标本检测凝固时间不在标准曲线范围可稀释后检测。.血浆因子H、V、皿和X的促凝活性测定（1）原理：将待测血浆分别与缺乏FII、FV、F皿和FX基质血浆混合，进行PT测定。将正常人混合血浆与乏因子血浆混合，测定PT,作出标准曲线。从各自的标准曲线中分别计算出受检血浆中FII：C、FV：C、F皿：C和FX：C相当于正常人的百分率（％）。（2）临床意义1）增高：见于血栓前状态和血栓性疾病。2）减低：见于维生素K缺乏症（FV除外）、肝脏疾病、DIC、口服抗凝剂和血中存在相应的抑制物。先天性因子H、V、皿和X缺乏症较罕见。目前因子FII：C、FV：C、F皿：C和FX：C的测定主要用于肝脏受损的检查，因子皿：C在肝脏早期可下降，因子V的测定在肝损伤和肝移植中应用较多。.血浆因子XIII定性试验（1）原理：在钙离子作用下，因子XI能使溶解于尿素溶液的可溶性纤维蛋白单体聚合物变为不溶性的纤维蛋白。因此，含因子XI的血浆钙化凝固后不再溶于尿素溶液中，而缺乏XI的血浆聚合物则可溶于5mol/L尿素溶液中。（2）临床意义：本试验简单、可靠，是十分有用的过筛试验。在临床上若发现伤口愈合缓慢、渗血不断或怀疑有因子XI缺陷者，可首选本试验。若纤维蛋白在24h内，尤其是2h内完全溶解，表示因子XI缺乏，见于先天性因子XI缺乏或获得性因子XI缺乏，后者见于肝脏疾病、SLE、类风湿关节炎、恶性淋巴瘤、转移性肝癌、DIC及原发性纤溶等。.血浆因子XI亚基抗原测定（1）原理：凝血因子XI由两个亚基a和B构成。检测方法为免疫火箭电泳法：在含有FXIa亚基和B亚基抗血清的琼脂凝胶板中，加入受检血浆（抗原），在电场作用下，出现抗原-抗体反应形成的火箭样沉淀峰，此峰的高度与受检血浆中FXI亚基的浓度成正比。根据沉淀峰的高度，从标准曲线中计算出FXIa：Ag和FXIB：Ag相当于正常人的百分率（％）。（2）临床意义：同上。六、抗凝物质测定.抗凝血酶ni（antithrombinIIIactivity,ATTII：A）测定（i）血浆抗凝血酶m活性测定原理：发色底物法：受检血浆中加入过量凝血酶，使AT-m与凝血酶形成i：i复合物，剩余的凝血酶作用于发色底物S-2238,释出显色基因对硝基苯胺（PNA）,显色的深浅与剩余凝血酶呈正相关，而与AT-m呈负相关。根据标准曲线计算出AT：A的含量。（2）血浆抗凝血酶I抗原（AT：Ag）检测1）原理：免疫学方法如火箭电泳法、免疫酶标及免疫比浊法。2）临床意义①增高见于血友病、白血病和再生障碍性贫血等的急性出血期以及口服抗凝药物治疗过程中。②减低见于先天性和获得性AT-m缺乏症，后者见于血栓前状态、血栓性疾病和肝脏疾病、肾病综合征等。3）注意事项①标本不能用肝素抗凝。②AT-m抗原和活性测定最好同时检测，以利于进行先天性AT-m缺乏的分型。③在疑难DIC诊断时，AT-m水平下降具有诊断价值；急性白血病时AT-m水平降低更可看作是DIC发生的信号；抗凝治疗中，如怀疑肝素抵抗，可测定AT-m来确定；抗凝血酶代替治疗时，也应首选AT-m检测来监测。.血浆蛋白C（proteinC,PC）测定（1）血浆蛋白C活性测定原理：发色底物法：受检血浆中加入蛋白C激活剂（从蛇毒中提取）。PC被激活为活化蛋白C（APC）,APC作用于发色底物，释出显色基团对硝基苯胺（PNA）,显色的深浅与受检血浆中PC的含量呈平行关系。根据标准曲线计算出AT：A的含量。（2）血浆蛋白C抗原测定1）原理：免疫火箭电泳法。2）临床意义：减低见于：①先天性PC缺陷：根据PC：A和PC：Ag可分为1型（PC：Ag与PC：A均减低）和^型（PC：Ag正常而PC：A减低）；②获得性PC缺陷：DIC、肝功能不全、手术后、口服双香豆素抗凝剂、呼吸窘迫综合征等。.血浆蛋白S测定（1）血浆总蛋白S测定1）原理:血浆总蛋白S（totalproteinS,TPS）包括游离PS（FPS）和与补体C4结合的PS（C4bp-PS）。由于二者对于抗人蛋白S抗体有相似反应，因此用免疫学方法（如火箭电泳、酶联免疫法）检测的是TPS。2）临床意义：减低见于先天性和获得性PS缺陷症，后者见于肝脏疾病、口服抗凝药物等。（2）血浆游离蛋白S（freeproteinS,FPS）测定1）原理：凝固法。受检血浆中加入缺乏PS基质血浆（提供除PS外的其他凝血因子），PS可促进APC对因子Va的抑制作用，纤维蛋白形成所需的时间与受检血浆中FPS的量呈正相关。受检者凝固时间可从标准曲线中计算出FPS的含量。2）临床意义：参见血浆总蛋白S测定。七、病理性抗凝物检测.狼疮抗凝物质（lupusanticoagulants,LAC）测定（1）筛检试验1）原理：在脑磷脂和激活剂存在的条件下，检测血浆凝固时间（即APTT）。若被检血浆中有狼疮抗凝物质存在，则血浆凝固时间（APTT）延长。2）临床意义：筛检试验的血浆凝固时间延长（筛检试验阳性）见于有狼疮抗凝物质存在的患者、先天性凝血因子缺乏、口服抗凝剂、肝素治疗以及DIC等。（2）确诊试验1）原理：筛检是阳性的血浆，若属于有狼疮抗凝物质存在者，则在加入血小板溶解物后，延长的APTT被纠正。2）结果判断：筛选试验测定值/确诊试验测定值=0.8〜1.2。若筛查试验和确诊试验的凝固时间都延长，且比值在正常范围内，提示被检血浆中无狼疮抗凝物存在，可能有其他异常抗凝物存在；若筛查试验的凝固时间延长，而确诊试验的凝固时间缩短（被纠正），提示有狼疮抗凝物存在。3）临床意义：狼疮抗凝物质存在见于系统性红斑狼疮代1£）、自发性流产、多发性血栓形成和血小板减少症等。4）临床评价：LAC的检测也可利用改良的Russell蛇毒稀释试验进行检测，该试验不受FXH及F皿异常的影响，受检血浆中肝素含量＜1.OU/ml对结果也无影响。.凝血因子皿抑制物检测（1）原理：将受检血浆与正常人新鲜血浆等量混合，在37℃中放置一定时间，按一期法测定混合血浆中的FW活性，同时与正常血浆中的FW活性比较。若受检血浆中存在因子皿抗体，则正常人血浆的FW活性被抑制或被中和。以Bethesda单位来计算抑制物的含量，能抑制正常人FW活性50%的因子抗体定为1个Bethesda单位。抑制正常人血浆FW活性50%的受检血浆最高稀释倍数为FW抗体的单位数。（2）参考范围：正常人无FW抑制物。（3）临床意义：阳性见于反复输血、接受抗血友病球蛋白治疗的血友病A患者、SLE、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、妊娠、恶性肿瘤、DM、结节病等。（4）临床评价：Bethesda法还可用于其他因子如FIX、FX、FXI等抑制物的评价。本法对同种免疫引起的因子抑制物测定较为敏感，对自身免疫、药物免疫、肿瘤免疫和自发性凝血因子抑制物则不敏感。FW抑制物的确定最终还需进行LAC检测以进行排除。八、纤溶活性测定.凝血酶时间（thrombintime,TT）及甲苯胺蓝纠正试验（1）原理：受检血浆中加入“标准化”凝血酶溶液，测定开始出现纤维蛋白丝所需的时间。纠正试验：甲苯胺蓝可纠正肝素的抗凝作用，在TT延长的血浆中加入少量的甲苯胺蓝，若延长的TT明显恢复正常和缩短，表示受检血浆中肝素或类肝素样物质增多，否则为其他类抗凝物或是纤维蛋白原异常。（2）临床意义：受检TT值延长超过正常对照3秒为延长，见于低（无）纤维蛋白原血症；血中FDP增高（DIC）；血中有肝素和类肝素物质存在（如肝素治疗中、SLE和肝脏疾病等）。.血浆纤溶酶原测定（1）血浆纤溶酶原活性（plasminogenactivity,PLG：A）测定1）原理：发色底物法，受检血浆中加链激酶（SK）和发色底物（S-2251）,受检血浆中的PLG在SK的作用下，转变成PL,后者作用于发色底物，释出对硝基苯胺（PNA）而显色。显色的深浅与纤溶酶的水平呈正相关，通过计算求得血浆中PLG：A的含量。2）临床意义：增高表示纤溶活性减低，见于血栓前状态和血栓性疾病。减低表示纤溶活性增高，见于原发性纤溶、继发性纤溶和先天性PLG缺乏症。PLG缺陷症：可分为CRM+型（PLG：Ag或PLG：A减低）和CRM-型（PLG：Ag和PLG：A均减低）。此外，前置胎盘、肿瘤扩散、大手术后、肝硬化、重症肝炎、门脉高压、肝切除等获得性PLG缺陷症，也存在PLG减低。（2）血浆纤溶酶原抗原（plasminogenantigen,PLG：Ag）测定1）原理：ELISA法，将纯化的兔抗人纤溶酶原抗体包被在酶标反应板上，加入受检血浆，血浆中的纤溶酶原与包被在反应板上的抗体结合，然后加入酶标记的兔抗人纤溶酶原抗体，酶标记的抗体与结合在反应板上的纤溶酶原结合，最后加入底物显色，显色的深浅与受检血浆中纤溶酶原的含量呈正相关。从标准曲线中计算出血浆中纤溶酶原的含量。2）临床意义：见PLG：A测定。.血浆组织纤溶酶原活化剂测定（1）血浆组织纤溶酶原活化剂活性（tissueplasminogenactivatoractivity，t-PA：A）测定1）原理：发色底物法。血浆优球蛋白部分含有t-PA及全部凝血因子，但不含PAI。受检血浆加入过量PLG和纤维蛋白的共价物，血浆中的t-PA吸附于纤维蛋白上，并使PLG转变成PL，PL使发色底物（S-2251）释出PNA而显色，显色的深浅与受检血浆中t-PA的含量呈正相关。所测得的A值，可从标准曲线中计算出受检血浆中t-PA：A的含量。2）临床意义①增高：表明纤溶活性亢进，见于原发性纤溶症、继发性纤溶症如DIC等。②减低：表明纤溶活性减弱，见于血栓前状态和血栓性疾病，如动脉血栓形成、深静脉血栓形成、高脂血症、口服避孕药、缺血性中风等。（2）血浆组织纤溶酶原活化剂抗原（tissueplasminogenactivatorantigen，t-PA：Ag）测定1）原理：ELISA法。将纯化的抗t-PA单克隆抗体包被在酶标反应板上，加入受检血浆，血浆中的t-PA与包被在反应板上的抗体结合，然后加入酶标记的t-PA抗体，酶标记的抗体与结合在反应板上的t-PA结合，最后加入底物显色，显色的深浅与受检血浆中t-PA的含量呈正相关。从标准曲线中计算出血浆中t-PA的含量。2）临床意义:同t-PA：A检测。.血浆纤溶酶原活化抑制物测定（1）原理：血浆纤溶酶原活化抑制物活性（plasminogenantigeninhibitoractivity，PAI：A）检测，发色底物法。（2）临床意义：增高见于血栓前状态和血栓性疾病。减低见于原发性和继发性纤溶症。根据PAI：A和PAI：Ag的检测结果，可将PAI-1缺陷分为CRM+型和CRM-型。.血浆a2纤溶酶抑制物测定（1）原理：血浆a纤溶酶抑制物活性（aplasmininhibitoractivity，aPI：A）检测，发色底物法。（2）临床意义：增高见于静脉和动脉血栓形成、恶性肿瘤、分娩后等。减低见于肝病、DIC、手术后、先天性aPI缺乏症。根据aPI：A和a2PI：Ag检测的结果，可将a2PI缺陷分为CRM+型和CRM-型。.血浆鱼精蛋白副凝固（plasmaprotamineparacoagulationtest，3P）试验（1）原理：受检血浆中加入硫酸鱼精蛋白溶液，如果血浆中存在可溶性纤维蛋白单体-纤维蛋白降解产物复合物，则鱼精蛋白使其解离释出纤维蛋白单体。纤维蛋白单体自行聚合成肉眼可见的纤维状物，此为阳性反应结果。（2）结果判断：正常人为阴性。（3）临床意义：阳性见于DIC的早、中期，但在恶性肿瘤、上消化道出血、外科大手术后、败血症、肾小球疾病、人工流产、分娩等也可出现假阳性。阴性见于正常人、晚期DIC和原发性纤溶症。.血清纤维蛋白降解产物［fibrin（ogen）degradationproducts，FDP］测定（1）原理：胶乳凝集法，于被检血清中加入FDP抗体包被的胶乳颗粒悬液，当血清中FDP的浓度等于或超过5ug/ml，便与胶乳颗粒上的抗体结合，则胶乳颗粒发生凝集。根据被检血清的稀释度可计算出血清FDP的含量。(2)临床意义：血清FDP增高见于原发性纤溶症、DIC、恶性肿瘤、急性早幼粒细胞白血病、肺栓塞、深静脉血栓形成、肾脏疾病、肝脏疾病、器官移植的排斥反应、溶栓治疗等。.血浆D-二聚体(D-dimer，D-D)测定(1)原理：胶乳凝集法，被检血浆中加入标记D-二聚体单抗的胶乳颗粒悬液，如果血浆中D-二聚体含量大于0.5mg/L时，便与胶乳颗粒上的抗体结合，胶乳颗粒则发生凝集。根据被检血浆的稀释度可计算出血浆D-二聚体的含量。(2)临床意义：在DIC时，为阳性或增高，是诊断DIC的重要依据。高凝状态和血栓性疾病时，血浆D-二聚体含量也增高。D-二聚体在继发性纤溶症为阳性或增高，而原发性纤溶症为阴性或不升高，此是两者鉴别的重要指标。九、血液流变学检测.全血黏度.血浆黏度(1)原理：毛细管黏度计法。通过一定体积的受检血浆流经一定直径和一定长度的毛细管所需的时间与该管两端压力差计算出血浆黏度值。(2)临床意义：增高见于血浆球蛋白和血脂增高的疾病，如多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症、糖尿病、高脂血症等。经典例题对于临床上的出血的筛检实验APTT和PT都正常多见于A.内源性凝血途径缺陷引起的出血性疾病B.外源性凝血途径缺陷引起的出血性疾病C.共同凝血途径缺陷引起的出血性疾病D.各种血栓与止血改变处于代偿状态E.血液循环中存在抗凝物质『正确答案』D『答案解析』对于临床上的出血的筛检实验APTT和PT都正常多见于各种血栓与止血改变处于代偿状态。关于FDP和D-二聚体测定的叙述，下列哪项是正确的A.FDP是指纤维蛋白原的降解产物，不包括纤维蛋白的降解产物B.FDP增高是DIC的决定条件C.FDP增高是体内纤溶亢进的标志，可以鉴别原发与继发纤溶D.FDP增高主要见于容易发生DIC的基础疾病E.D-二聚体是原发性纤溶的标志『正确答案』D『答案解析』FDP指的是血清纤维蛋白降解产物。D-二聚体是诊断DIC的重要依据，在继发性纤溶症为阳性或增高，而原发性纤溶症为阴性或不升高，此是两者鉴别的重要指标。在关于PT测定下列说法错误的是A.PT测定是反映外源凝血系统最常用的筛选试验B.口服避孕药可使PT延长C.PT测定时枸橼酸钠与血液的比例是1:9D.PT的参考值为11〜14秒，超过正常3秒为异常E.肝脏疾病及维生素K缺乏症时PT延长『正确答案』B『答案解析』PT缩短见于口