2023学年完整公开课版衍生化技术HPLC

HPLC衍生化技术

衍生化是药物分析中常用的一种分析手段。其原理是待测样品与衍生化试剂定量快速反应，并加入特定的功能的基团生成符合检测要求的衍生化物，通过检测生成衍生化物的量间接测定待测样品的量。化学衍生化的目的:通过合适的化学反应,生成特殊衍生化物，1.改变待测物的色谱色谱保留特性以改善分离度；2.改变待测物的检测特性，以增加其对检测器的响应（例：紫外标记、荧光标记、电化学标记）；3.生成稳定的衍生化物，改善待测物的不稳定性（例：-SH基团易氧化的问题可通过酰化来解决）。

HPLC化学衍生化分类

在线化学衍生化

★是否与HPLC系统联机

离线化学衍生化

柱前衍生化

★发生衍生化发应的先后

柱后衍生化柱前衍生化

在色谱分离前，预先将样品制成适当的衍生物，然后再进入色谱柱进行分离检测。优点：（1）对用作流动相的溶剂体系没有限制；（2）反应条件，反应速率不受限制；（3）通过选择合适的试剂以及萃取方法，可以消除许多干扰；（4）过量溶剂、试剂容易除去；（5）转变成合适的衍生物，可使分离度改进。缺点:（1）操作过程繁琐，容易影响定量准确性。（2）当一个复杂组分样品经过衍生化反应后，有可能产生多种衍生化产物给色谱分离带来困难。柱后衍生化

将样品先注入色谱柱，按选定的色谱条件使样品组分得以分离，当各个组分从色谱柱流出后，分别与衍生化试剂相遇，在一定的反应条件下，生成具有某种检测特性的衍生化产物再进入检测器。

要求：（1）对流动相的选择更严格，必须考虑衍生化试剂、反应产物的溶解度，以及它们与流动相可能发生的副反应；（2）由于在高效液相色谱中采用高流速，因此反应速率必须很快（小于30s）；（3）检测器对衍生化试剂不能有响应。

柱后衍生流程图如下：

泵进样阀色谱柱衍生化试剂泵反应器检测器记录仪

紫外衍生化荧光衍生化电化学衍生化手性衍生化固定化酶反应器（IMER）衍生化反应类别：一、紫外衍生反应

在液相色谱法中，紫外吸收检测器是最常见的一种高灵敏度检测器。但很多化合物在紫外可见光谱区无吸收，而不能被检测。将它们与带有紫外吸收基团的衍生试剂在在一定条件下发生反应，由于反应产物带有发色基团而能被检测。例、酰氯类衍生化试剂

苯甲酰氯及其衍生物可与胺类化合物反应生成强紫外吸收的苯甲酸酯类衍生物。反应式：

二、荧光衍生反应在液相色谱法中，荧光检测器是一种高灵敏度、高选择性的检测器，比紫外检测器的灵敏度要高10到1000倍，因此，为了检测痕量非荧光物质，常将它与荧光衍生化试剂反应，生成荧光物质，然后用荧光检测器检测．例、福多司坦血药浓度测定方法的建立福多司坦的药理作用

福多司坦(S-（3羟基丙基）-L-半胱氨酸,Fudosteine)为新的具有粘液活性的半胱氨酸衍生物，祛痰效果极强，而毒副作用极小（

对大鼠和小鼠LD50>10g/kg），化学性质稳定。

获准的适应症：咳嗽，慢性支气管炎，支气管扩张症，尘肺病，肺气肿，非定型抗酸菌症等疾患的祛痰。

例、福多司坦血药浓度测定方法的建立2、半胱氨酸结构式：1、福多司坦结构式:

结构特点3、结构特点：为半胱氨酸衍生物；

没有强的紫外吸收，没有荧光；分子量小，极性大。例、福多司坦血药浓度测定方法的建立福多司坦结构式:伯氨基羧基

参考氨基酸的测定方法，选择合适的衍生化试剂衍生化后测定。在流动相中扫描福多司坦衍生化产物的激发波长为338nm，发射波长为450nm；例、福多司坦血药浓度测定方法的建立

反应过程：荧光衍生试剂的基本构成取代基荧光团（试剂分子母体）反应基团胆磺酰肼DNS-H荧光衍生化试剂的分类：（一）胺的衍生试剂（二）醇、酚的衍生试剂（三）羰基化合物的衍生试剂（四）羧酸类化合物的衍生试剂邻苯二甲醛OPA4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑

NBD-Cl荧光素异硫氰酸酯FITCFMOC芴代甲氧基酰氯6-氨喹啉基琥珀酰亚胺碳酸酯AQC（一）胺的衍生试剂分子式：（二）醇、酚的衍生试剂:

羰基氯类：FMOC,CEOC磺酰氯类:DNs-Cl卤代三嗪类:EDTN

1-乙氧基-4-(二氯-三嗪)萘（EDTN）

（三）羰基化合物的衍生试剂:

肼类DNs-HCEOC-H

氨基类氨基甲基芘

（四）羧酸类化合物的衍生试剂:

溴甲基类BrMMC

哌嗪基类DBD-Pz

重氮甲烷基类ADAM

其它类9-(2-羟乙基)-吖啶酮HEA4-氨甲基-6，7-二甲基香豆素(ADMC)7-N-哌嗪-4-二甲氨基苯并呋喃9-蒽重氮甲烷9-蒽重氮甲烷(4-溴甲基-7-甲氧基香豆素)三、电化学衍生反应

指样品与某些试剂反应，生成具有电化学活性的衍生物，以便在电化学检测器上有较高的响应。环境介质对电化学反应有很大影响，如离子强度、pH值和溶剂组成等。

常用的电化学衍生化试剂：

⑴还原衍生试剂

最常用的还原衍生试剂是带硝基的芳香化合物。这些带硝基的衍生物能分别与羟基、氨基、羧基、羰基化合物反应生成具有电化学活性的衍生物。尽管这些衍生物都可用紫外检测器，但电化学检测的灵敏度高，选择性更好。

⑵氧化衍生试剂

氧化衍生基团有芳氨基、酚羟基等。氧化衍生反应时，氧不干扰测定。许多紫外和荧光衍生试剂同样可用于电化学衍生。

四、手性衍生化

用手性试剂与外消旋体反应，在分子内导入另一手性中心，柱前衍生反应生成一对非对映异构体，两者间无镜相关系，物理化学性质不