发育生物学五周简

发育生物学五周简第1页/共64页一、程序性细胞死亡PCD（programmedcelldeath）又称细胞凋亡

(apoptosis)（在体内外因素诱导下，由基因严格调控而发生的自主性细胞有序死亡。）1、概念一个固有的遗传程序即生物钟，在一个受控制的时间和空间内激活，从而导致细胞死亡。第2页/共64页细胞凋亡与程序性细胞死亡

意义大致相同，二者可交互使用。比较说来程序性细胞死亡侧重于发育学功能上描述；强调死亡发生的时间；适用于胚胎细胞。细胞凋亡偏重于病理形态描述；强调细胞死亡的方式；适用于所有细胞。第3页/共64页蝌蚪尾的消失脊椎动物的神经系统的发育发育过程中手和足的成形过程第4页/共64页2、简史1885年，Flemming第一个描述有关细胞凋亡的特征；（染色质浓缩形成半月形）1914年，Graper用这种死亡现象解释胚胎发育中器官收缩等现象1951年，Glucksmann发现在胚胎发育中存在这种死亡，并详细描述；60年代，Lockshin和Williams首次提出‘‘程序性细胞死亡’’这一概念第5页/共64页1986年，Robert

Horvitz等发现线虫中ced3（caspase），ced4（Apaf-1）是促凋亡基因。1980年，Wyllie等发现细胞凋亡与内源性核酸内切酶激活有关。

“DNAladder”是细胞凋亡发生的标志；1965年，JohnKerr提出“固缩性坏死”概念；1972年，Kerr，Wyllie，Currie提出“细胞凋亡”（apoptosis）的概念；第6页/共64页二、PCD/细胞凋亡的形态变化(1)细胞皱缩变圆，微绒毛、复合体消失；出芽(budding)膜空泡化（blebbing)(2)胞质浓缩、细胞器结构保留(3)核浓缩；染色质凝聚(4)凋亡小体形成胞膜皱缩内陷，分割包裹胞质(内含DNA物质及细胞器)，形成的膜包颗粒即凋亡小体（apoptosisbody）

(5)吞噬第7页/共64页三、PCD/细胞凋亡的生理和生化变化磷脂酰丝氨酸外翻：annexinV基因转录和蛋白质合成：

与细胞骨架降解有关的酶谷胱甘肽转移酶、组织蛋白酶D、组织型纤维蛋白酶原激活剂等

与细胞和凋亡小体形态维持有关的蛋白质

簇因子、r-谷丙转氨酶等Ca2+、Mg2+依赖性的核酸内切酶活化：降解DNA，形成180-200bp或其倍数的DNA片段第8页/共64页PCD/细胞凋亡与坏死的区别★第9页/共64页细胞坏死(necrosis)

指由于某些外界毒性刺激（如局部缺血、高热、物理和化学损伤或生物的侵袭等），直接作用于细胞导致的细胞急速死亡，一般伴有炎症反应。

一般过程：因补体反应或烈性病毒感染破坏了质膜，或者能量依赖性离子泵被破坏产生的钠钾等离子沿着各自的浓度梯度进入细胞，从而导致细胞吸水膨胀，最终破膜而死。第10页/共64页细胞凋亡与细胞坏死是多细胞生物细胞死亡的两种不同形式，在形态学、生化代谢、分子机制、结局和意义等方面都有本质的区别。

细胞坏死特征：溶酶体释放酶，细胞器瓦解，细胞骨架降解，细胞核破裂、降解，蛋白质合成终止，由于膜破裂，出现炎症反应第11页/共64页细胞坏死细胞凋亡1.性质病理性生理性或病理性2.诱导因素强烈刺激，随机发生较弱刺激，非随机发生3.生化特点被动过程，无新蛋白合成，不耗能主动过程，有新蛋白合成，耗能4.形态变化细胞肿胀、细胞结构全面溶解、破坏胞膜及细胞器相对完整，细胞皱缩，核固缩5.DNA电泳弥散性降解，电泳呈均一DNA片状DNA片段化（180-200bp），电泳呈梯状条带6.炎症反应溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体相对完整，局部无炎症反应7.凋亡小体无有8.基因调控无有表8－1细胞凋亡与细胞坏死的比较第12页/共64页三、胚胎发育中的程序性细胞死亡（PCD）

（一）PCD参与了各器官的形态发生和发育。1、肢体的发生2、中枢神经系统的发生、发育3、腭的发生4、管（腔）道的形成5、晶状体的发育6、心的发育7、生殖细胞的发生8、免疫、造血系统的发生9、无用结构的退化消失（弓动脉、前肾、中肾、尾芽、鳃膜等）第13页/共64页实验将17期的鸡胚翅芽后缘的细胞移植到另一不同胚龄鸡胚的体节中，发育至24期时仍发生死亡。将17期的鸡胚翅芽后缘以外的细胞移植到另一不同胚龄鸡胚的体节中，发育至24期时不发生死亡。

证明鸡胚翅芽后缘细胞的死亡有着预定的时间和空间程序。第14页/共64页（二）胚胎发育中PCD的意义1、系统匹配淘汰没有作用或不再起作用的细胞，以确保有功能细胞的营养和空间。2、除去短暂结构：人胚尾芽3、雕刻躯体从而形成正常、精细复杂的生物体。4、保护机体：如胸腺的发育、损伤的胚胎细胞第15页/共64页四、PCD/细胞凋亡的调节（一）激素水平的调节：甲状腺素（蝌蚪）、糖皮质激素（胸腺cell）、苗勒抑制物质（中肾旁管）等诱导PCD雌激素及卵泡刺激素（颗粒细胞）、胰岛素（晶状体上皮细胞）等抑制PCD（二）细胞因子调节主要是生长因子：NGF，FGF，TGF，G-CSF等缺乏导致PCD第16页/共64页（三）PCD相关基因/蛋白的调节1、TNF死亡受体超家族（1）死亡受体：Fas、TNFRI等（2）与死亡受体有关的含死亡结构域的信号蛋白：FADD（FAS相关死亡蛋白）、TRADD（TNFRI相关死亡蛋白）等第17页/共64页（1）死亡受体：Fas、TNFRI等结构特点：

胞内C-端：胞内功能区由80个氨基酸构成的死亡结构域（deathdomain，DD）

跨膜区

胞外N-端：胞外功能区内含数个半胱氨酸第18页/共64页（2）含有死亡结构域的信号蛋白TRADD（TNFR相关死亡蛋白）：34kD，C端的DD与TNFRI，FADD的DD结合FADD（Fas相关死亡蛋白）

（MORT-1）：23kD，C-端含有一个DD(deathdomain)，可与Fas结合；N-端含有

MORT结构域或死亡效应结构域（DED:deatheffectordomain），可与

proCaspase-8（FLICE）的DED结合第19页/共64页Fas(Apo-1,CD95):43kD

（三聚体FasL-----Fas------FADD（Fas相关死亡蛋白）--------proCaspase-8）(

DISC/死亡诱导信号复合物):活化Bid、caspase-3

DED:deatheffectordomainTNFRI（TNFR55）：55-60kD，TNFRI-------TRADD（TNFR相关死亡蛋白）------FADD--------proCaspase-8

DDDEDDDDDDED第20页/共64页Fas/FasLDD:deathdomain第21页/共64页凋亡诱导因素死亡受体（Fas)配体（FasL)的表达、结合Caspase-8活化Caspase-3活化apoptosisFADDFADD第22页/共64页2.凋亡蛋白酶Caspase:

cysteine-containingaspartate-specificprotease（含半胱氨酸的天冬氨酸特异蛋白水解酶）一组对底物的天冬氨酸部位有特异水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶。(1)定义第23页/共64页（2）Caspase的分类及功能凋亡启动亚类(DED、CARD)凋亡效应亚类细胞因子加工亚类（ICE亚类）第24页/共64页Caspases激活的瀑布学说(级联反应)第25页/共64页(3)结构特征①以无活性的酶原形式存在；②N端均含有一段前区域（内含DED、CARD)；CARD:CaspaseActivationandRecruitmentDomain第26页/共64页④在大亚基的C端含有一活性中心，其中半胱氨酸是必需氨基酸。③活性形式由2个大亚基和2个小亚基组成的杂四聚体；ActiveenzymeCatalyticsites第27页/共64页(4)

Caspase的作用底物

①凋亡蛋白酶激活的DNA酶抑制物(ICAD)CAD:CaspaseActivatedDNase由Caspase激活的核酸酶(具有内切酶活性)ICADCADDNACaspase第28页/共64页②核纤层（lamina）蛋白细胞核lamina染色体第29页/共64页③细胞骨架蛋白：导致细胞解体，形成凋亡小体

④其他的caspases⑤灭活细胞凋亡的抑制物第30页/共64页3、凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1)

130kD，N-端含有一半胱氨酸蛋白酶募集域（CARD），C-端由12个WD-40重复片段组成。凋亡体/死亡复合体：Cytc-Apaf-1-dATP

（闭合的单体聚合成开放的七聚体）Cytc-Apaf-1-dATP-proCaspase-9第31页/共64页凋亡复合体CARD:Caspase ActivationandRecruitmentDomain第32页/共64页4、线粒体膜间隙蛋白（线粒体释放的凋亡相关因子）细胞色素C，凋亡诱导因子，Apaf-1,Ca2+,

Smac/DIABLO等5、自由基活性氧自由基（超氧阴离子自由基、羟自由基及单线态氧，H2O2等）：诱导PCD的发生。活性氮自由基：NO—高浓度促PCD，低浓度抑制PCD第33页/共64页6、P53基因阻滞细胞G1期，修复受损的DNA，如修复失败则通过多种途径诱导细胞凋亡。（射线、毒素）分子警察第34页/共64页P53的促凋亡机制：（1）DNA结合蛋白，调控基因（BAX等)转录（细胞核途径）（2）激活线粒体途径（3）诱导Fas增加（4）诱导溶酶体的不稳定性第35页/共64页7、BcL-2家族3个亚家族抗凋亡蛋白亚家族（BcL-2亚家族）含多区域的促凋亡蛋白亚家族（Bax亚家族）仅含BH3区域的促凋亡蛋白亚家族（BH3亚家族）基本结构特征：跨膜结构域

BcL-2同源结构域（BH）第36页/共64页第37页/共64页第38页/共64页

BcL-2基因家族成员自身或彼此之间有形成二聚体或多聚体的能力，BcL-2家族通过蛋白与蛋白相互作用调节着细胞的存活与凋亡。第39页/共64页第40页/共64页Bcl-2（B

celllymphoma/leukemia-2）

：

Bcl-2

是第一个被确认有抗凋亡作用，由229aa构成（鼠236）分布在线粒体膜,内质网，核膜等处。

Bcl-2

和C.elegans

中的ced-9

有很高的同源性，具有促进细胞存活的功能。第41页/共64页BcL-2抗凋亡机制：①直接抗氧化；②调节PTP（线粒体通透性转换孔）开放；③抑制Bax，Bak的促凋亡作用；④抑制Caspases激活；⑤维持细胞钙稳态。第42页/共64页8、凋亡抑制蛋白家族（IAP家族）

IAP家族是一组抑制凋亡的蛋白。IAP家族蛋白的主要结构域：BIR

（baculoviralIAPrepeat),锌指结构域、CARD。BIR2是IAP

抑制凋亡的结构基础。作用机制：抑制caspase-3,7,9等的活性。第43页/共64页Figure1SchematicdiagramofdomainstructureinrepresentativeIAPs第44页/共64页凋亡细胞DNA的断裂形成高分子量的DNA大片断（50kb)形成180－200bp整数倍的DNA小片断非Caspase依赖的内源性核酸内切酶的激活Caspase依赖的内源性核酸酶激活(CAD)9.核酸内切酶第45页/共64页

Caspase8

Caspase3

Caspase9

Cleavageofsubstrates

Nucleus

DegradationofDNACAD激活方式细胞膜第46页/共64页DNA断裂与“梯状条带”第47页/共64页第48页/共64页（二）、PCD的主要途径1.膜受体通路(死亡受体通路/外源性通路)肿瘤坏死因子死亡受体(TNFR)家族中的死亡受体：Fas／CD95，TNFR第49页/共64页Fas/FasLDD:deathdomain第50页/共64页死亡受体通路凋亡诱导因素死亡受体（Fas)配体（FasL)的表达、结合Caspase-8活化Caspase-3活化apoptosisFADDFADD第51页/共64页2.线粒体通路（内源性途径）线粒体通透性转换孔（MPTP）：由内膜的腺苷转位因子和外膜的电压依赖性阴离子通道）构成的蛋白复合体。第52页/共64页第53页/共64页1、线粒体跨膜电位（Δψm）的破坏与细胞凋亡的一致性；

Δψm下降时PTP开放导致细胞凋亡

Δψm正常时无细胞凋亡

2、线粒体跨膜电位（Δψm）的破坏早于核DNA的断裂。第54页/共64页??线粒体信号通路smacSmac:secondmitochondria-derivedactivatorofcaspaseIAPs(-)ApoptosisinducingfactorInhibitorsofapoptosisproteinapoptoticproteaseactiviationfactor第55页/共64页凋亡诱导因素死亡受体/配体的表达、结合Caspase-8活化Caspase-3活化apoptosisBid活化线粒体通路活化死亡受体通路与线粒体通路的