高中生物竞赛课件：蛋白质的性质与分离、分析技术

蛋白质是由氨基酸组成的高分子有机化合物，因此其性质必定有一部分与氨基酸相同或相关，例如两性解离及等电点、紫外吸收性质、呈色反应等等。但是，蛋白质作为高分子化合物，它又表现出与低分子化合物有根本区别的大分子特性，如胶体性、变性和免疫学特性等。蛋白质的性质与分离、分析技术一、

蛋白质的分子量二、

蛋白质的两性电离与等电点三、

蛋白质的变性四、

蛋白质的胶体性质五、

蛋白质的沉淀反应六、

蛋白质的颜色反应七、

蛋白质的含量测定（1）蛋白质的分子量蛋白质的性质与分离、分析技术蛋白质是一类高分子化合物，在溶液中的形状根据不对称常数分为球形、椭圆形、纤维状等。分子量一般为104~106道尔顿或更高，通常将分子量低于1万者称为多肽，高于1万者称为蛋白质。当然这种界限并不是很严格的，如胰岛素的分子量为5437，但习惯上称作蛋白质，有时亦称多肽。高分子特性是蛋白质的重要性质，也是蛋白质胶体性、变性和免疫学性质的基础。因此，测定蛋白质分子的大小是蛋白质化学的重要内容。测定蛋白质分子量有超速离心法、凝胶过滤法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、生物质谱法等。1、蛋白质的性质（1）蛋白质的分子量蛋白质的性质与分离、分析技术凝胶过滤法：也称分子排阻/分子筛层析蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接取决于分子的质量，而是斯托克半径。如果某种蛋白质与一理想的非水化球体具有相同的过柱速度即相同的洗脱体积，则认为这种蛋白质具有与此球体相同的半径，称斯托克半径测定方法：先测几种相对分子质量已知的蛋白质标准物的过柱体积Ve，做Mr的对数与Ve标准曲线图，然后测出待测蛋白质样品的Ve，从标准曲线图中确定样品的Mr1、蛋白质的性质（1）蛋白质的分子量蛋白质的性质与分离、分析技术凝胶过滤法：也称分子排阻/分子筛层析大分子沿着凝胶颗粒之间的空隙移动，先洗脱出来小分子进入凝胶颗粒内部，后洗脱出来常用的填充材料是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶1、蛋白质的性质（1）蛋白质的分子量蛋白质的性质与分离、分析技术SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳法：聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)依据：不同蛋白质所带电荷(电荷效应)和大小差异(分子筛效应)SDS：加入十二烷基硫酸钠(SDS)，消除电荷的差异1、蛋白质的性质测出的是亚基的Mr，若待测蛋白质是多亚基的，则需配合使用凝胶过滤法确定整个分子的Mr（2）蛋白质的两性电离与等电点蛋白质的性质与分离、分析技术蛋白质由氨基酸组成。AA分子含有氨基和羧基，既可接受质子，又可释放质子，因此AA是两性电解质。蛋白质分子中除两末端有自由的α-NH2和α-COOH外，许多AA残基的侧链上有不少可解离基团，如-NH2、-COOH、-OH等，故蛋白质也是两性物质蛋白质与氨基酸一样在纯水溶液和结晶状态中都以两性离子的形式存在，即同一分子中可带有正负两种电荷，羧基带负电而氨基带正电。1、蛋白质的性质（2）蛋白质的两性电离与等电点蛋白质的性质与分离、分析技术蛋白质在溶液中的带电情况主要取决于溶液的pH。使蛋白质所带正负电荷相等，净电荷为零时溶液的pH，称为蛋白质的等电点(isoelectricpoint，pI)。各种蛋白质具有特定的等电点，这与其所含的AA种类和数目有关，即其中酸性和碱性AA的比例及可解离基团的解离度。蛋白质的等电聚焦1、蛋白质的性质（2）蛋白质的两性电离与等电点蛋白质的性质与分离、分析技术一般地说，含酸性AA较多的酸性蛋白，等电点偏酸；含碱性AA较多的碱性蛋白，等电点偏碱。当溶液的pH>pI时，蛋白质带负电荷；pH<pI时，则带正电荷。体内多数蛋白质的等电点为5左右，所以在生理条件下(pH≈7.4)，它们多以负离子形式存在

1、蛋白质的性质（2）蛋白质的两性电离与等电点蛋白质的性质与分离、分析技术等电点处的蛋白质的特点：蛋白质在pI时，以两性离子的形式存在，总净电荷为零，无电荷排斥，容易结合成较大的聚集体，所以溶解度最小，容易沉淀析出（应用：分离、提纯）蛋白质的黏度、渗透压、膨胀性以及导电能力均为最小1、蛋白质的性质蛋白质高分子特性形成了复杂而特定的空间构象，表现出特异的生物学功能。某些物理和化学因素使蛋白质分子的空间构象发生改变或破坏，导致其生物活性的丧失和一些理化性质的改变，这种现象称为蛋白质的变性作用(denaturation)（3）蛋白质的变性(denaturation)蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质次级键破坏(本质)，一级结构不变，组成成分和Mr不变生物活性丢失（最主要的特征）酶-催化能力、血红蛋白-氧运输、胰岛素-降血糖理化性质改变基团暴露疏水基团→溶解度↓→沉淀析出←肽链松散，相互缠绕反应基团（-SH、-S-S-基、酚羟基等）结晶能力丧失球状蛋白质分子形状发生改变（3）蛋白质的变性(denaturation)蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质RNase的变性和复性实验去除尿素和巯基乙醇牛胰RNase共有124个AA残基，4个链内二硫键复性过程中-S-S-正确连接的概率：

***1=一级结构决定空间结构蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质（3）蛋白质的变性(denaturation)蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质（3）蛋白质的变性(denaturation)引起蛋白质变性的因素物理因素：高温、紫外线、X-射线、超声波和剧烈振荡等；化学因素：强酸、强碱、尿素、去污剂、重金属(Hg2+、As+、Pb2+)、三氯醋酸、浓乙醇等变性的种类可逆变性：除去变性物质后，蛋白质的构象可以恢复原状，生物功能也随之恢复(蛋白质的复性(renaturation))不可逆变性：除去变性因素时，蛋白质的构象不恢复原状，生物功能也不恢复蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质（3）蛋白质的变性(denaturation)变性作用不仅对研究蛋白质的结构与功能方面有重要的理论价值，而且对医药的生产和应用亦有重要的指导作用实践中对蛋白质的变性作用有不同的要求，有时必须尽力避免，而有时则必须充分利用：酒精、紫外线消毒，高温、高压灭菌→细菌蛋白变性失去活性中草药有效成分提取或其注射液制备→加热、浓乙醇等除去杂蛋白制备有生物活性的酶，蛋白质，激素或其他生物制品(疫苗、抗毒素等)时，要求所需成分不变性，而不需的杂蛋白应变性或沉淀除去。此时，应选用适当方法，严格控制操作条件，尽量减少所需蛋白质变性。有时还可加些保护剂、抑制剂等以增强蛋白质的抗变性能力蛋白质变性的意义（4）蛋白质的胶体性质蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质蛋白质是高分子化合物。由于其分子量大，在溶液中所形成的颗粒大小为1-100nm，达到胶体质点的范围，所以蛋白质具有胶体性质。如布朗运动、光散射现象、不能透过半透膜以及具有吸附能力等胶体溶液的一般特征蛋白质的水溶液是比较稳定的亲水胶体：表面带有跟水具有高度亲和性的极性基团(-NH2、-COOH、-OH、-SH、-CONH2)，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)→不易聚集→不易沉淀同一种蛋白质分子在非pI时带有同种电荷→相互排斥→不致互相凝集沉淀电荷+水膜→胶体中和电荷/破坏水膜→沉淀温和→非变性的蛋白质沉淀强烈→蛋白质变性沉淀（5）蛋白质的沉淀蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质（5）蛋白质的沉淀蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质沉淀的方法：高浓度盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等中性盐使蛋白质产生沉淀(盐析法)(破坏水膜，中和电荷)蛋白质不变性→分离制备有活性的蛋白质分段盐析：调节盐浓度使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，如：血清→硫酸铵至50%饱和度(析出球蛋白)→硫酸铵至饱和(析出清蛋白)；盐溶：在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大有机溶剂：乙醇、丙酮等破坏蛋白质分子周围的水膜低温条件下，蛋白质一般不变性，沉淀效果优于盐析pI条件下效果更好（5）蛋白质的沉淀蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质重金属盐：蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与重金属(氯化高汞、硝酸盐、醋酸铅、三氯化铁)的正离子作用生成不易溶解的盐蛋白质变性，沉淀效率高，常用除去样品蛋白质杂质化验血清非蛋白成分，用三氯醋酸或钨酸盐沉淀蛋白质加某些酸类：苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质形成不溶解的盐蛋白质变性，常用除去样品蛋白质杂质（5）蛋白质的沉淀蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质加热：使大多数蛋白质变性沉淀，去除样品中蛋白质杂质的常用方法调节溶液pH（6）蛋白质的颜色反应蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质双缩脲反应：由两分子尿素缩合而成的双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生紫红色络合物肽键的反应定性或定量(540nm处比色)酚试剂(福林试剂)反应：酪氨酸中的酚基能将福林试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物定量测定蛋白质含量，灵敏度>双缩脲法（7）蛋白质含量的测定蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质凯氏定氮法：N在蛋白中的平均含量16%，测可溶性和不溶性蛋白的总蛋白含量蛋白质含量=(总氮含量-无机氮含量)×6.25不能区分蛋白氮和非蛋白氮，计算出的蛋白含量称作粗蛋白含量系数6.25对某些蛋白质不合适，需要用校正后的系数紫外吸收法：蛋白质（Tyr、Trp和Phe）在280nm左右有强烈的光吸收，测定蛋白质溶液的A280nm和A260nm（准确度不高）蛋白质质量浓度（mg/mL）=1.45A280nm-0.47A260nm（7）蛋白质含量的测定蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质考马斯亮蓝染色法：室温，反应迅速（2min），生成物稳定，测定蛋白质含量的灵敏度较高（ug）（7）蛋白质含量的测定蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质福林-酚试剂法(Lowry法)：测定蛋白质浓度应用最广泛的一种方法。原理：碱性条件下蛋白质与Cu2+生成复合物，还原磷钼酸-磷钨酸试剂生成蓝色化合物，可用比色法测定。优点：操作简便、灵敏度高、蛋白质浓度范围25-250μg/mL缺点：此法实际上是蛋白质中酪氨酸和色氨酸与试剂的反应，因此它受蛋白质的氨基酸组成的影响，即不同蛋白质中此两种氨基酸量不同使显色强度有所差异；此外，酚类等一些物质的存在可干扰此法的测定，导致分析的误差。（7）蛋白质含量的测定蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质双缩脲法：在碱性条件下，蛋白质分子中的肽键与Cu2+可生成紫红色的络合物，可用比色法定量。此法简便，受蛋白质氨基酸组成影响小；但灵敏度不高、样品用量大，蛋白质浓度范围为0.5-10mg/mLBCA比色法：在碱性溶液中，蛋白质将Cu2+还原为Cu+再与BCA试剂(4，4'-二羧酸-2，2'-二喹啉钠)生成紫色复合物，于562nm有最大吸收，强度与蛋白质浓度成正比。优点：单一试剂、终产物稳定，与Lowry法相比几乎没有干扰物质的影响。尤其在TritonX-100、SDS等表面活性剂中也可测定。其灵敏度范围一般在10-1200μg/mL免疫学方法(抗原-抗体特异结合)与荧光标记技术相结合，用于研究特异蛋白抗原在细胞内的含量和分布直接免疫荧光技术(A)：荧光分子与抗体偶联后直接用于免疫标记间接免疫荧光技术(B)：先将抗体(一抗)与抗原反应，然后加入与荧光分子相偶联的抗第一抗体的抗体(二抗)（7）蛋白质含量的测定蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位分类：免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术、免疫胶体金技术A.免疫胶体金标记技术原理的示意图：细菌蛋白A可与胶体金结合，也可以与抗体(如IgG)的Fc端特异结合。B.免疫胶体金标记膀胱上皮细胞膜蛋白的分布（箭头所指）（7）蛋白质含量的测定蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质蛋白质的性质与分离、分析技术2、蛋白质的分离和分析技术根据蛋白质溶解度不同进行分离根据蛋白质分子大小进行分离根据蛋白质带电性质进行分离根据配体特异性进行分离（1）根据蛋白质溶解度不同进行分离蛋白质的性质与分离、分析技术2、蛋白质的分离和分析技术

利用蛋白质溶解度的差异是分离蛋白质的常用方法之一。影响蛋白质溶解度的主要因素有溶液的pH、离子强度、溶剂的介电常数和温度等。在一定条件下，蛋白质溶解度的差异主要取决于它们的分子结构；如氨基酸组成、极性基团和非极性基团的多少等。因此，恰当地改变这些影响因素，可选择性地造成其溶解度的不同而分离。盐析：中性盐(硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠)硫酸铵分段盐析效果较优，不易引起蛋白质变性沉淀分离后需除盐a、透析法：蛋白质溶液装入透析袋内(玻璃纸)，用缓冲液进行透析，不断更换缓冲液(时间长，低温进行)b、柱层析：葡聚糖凝胶G-25或G-50（1）根据蛋白质溶解度不同进行分离蛋白质的性质与分离、分析技术2、蛋白质的分离和分析技术等电点沉淀法：等电点状态时颗粒之间的静电斥力最小，溶解度最小，各蛋白质等电点不同，调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀（1）根据蛋白质溶解度不同进行分离蛋白质的性质与分离、分析技术2、蛋白质的分离和分析技术低温有机溶剂沉淀法：乙醇或丙酮去除蛋白质的水膜，同时，将pH调到蛋白质的等电点使之沉淀，蛋白质较易变性(分离较稳定的蛋白质，低温进行)（2）根据蛋白质分子大小进行分离蛋白质的性质与分离、分析技术2、蛋白质的分离和分析技术透析与超滤法透析：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质(无机盐、单糖和氨基酸)分开超滤法：利用高压力或离心力，迫使水和其他小的溶质分子通过半透膜，蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的滤膜截留不同Mr的蛋白质（2）根据蛋白质分子大小进行分离蛋白质的性质与分离、分析技术2、蛋白质的分离和分析技术凝胶过滤法：也称分子排阻/分子筛层析大分子沿着凝胶颗粒之