TCALAS 106-2021 实验动物 结肠小袋纤毛虫核酸检测方法

ICS65.020.30B44中国实验动物学会团体标准T/CALAS106-2021实验动物 肠小袋纤毛虫核检测方法Laboratoryanimal—NucleicaciddetectionmethodofBalantidium2022-01-10 发布 2022-01-10 实施中国实验动物学会 发布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国实验动物学会归口。本文件由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查。本文件由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本文件起草单位：广西壮族自治区兽医研究所。本文件主要起草人：谢永平、贺会利、冯世文、潘艳、李军。鏈鏈鏈鏈实验动物 结肠小袋纤毛虫核酸检测方法范围本文件规定了检测实验动物结肠小袋纤毛虫核酸检测法。本文件适用于实验室对实验动物（猴、鼠、兔等）粪中的结肠小袋纤毛虫核酸的快速检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489《实验室生物安全通用要求》GB/T6682 《分析实验室用水规格和试验方法》NY/T541 《动物疫病实验室检验采样方法》GB/T27401 《实验室质量控制规范 动物检疫》《兽医实验室生物安全管理规范》（中华人民共和国农业部公告第302号）术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1环介导等温扩增loop-mediatedisothermalamplification，LAMP简称641560min内完成扩增，用于病原体的快速鉴定。3.1.2特异性引物specificprimer针对特定模板DNA片段设计一段寡核苷酸，在反应中与模板DNA特异性结合。试验材料引物根据结肠小袋纤毛虫（Balantidiumcoli）的18SrRNA基因设计引物，内引物7272中国实验动物学会团体标准汇编及实施指南（第六卷）405。RNase去离子水稀释。引物稀释后分装成小剂量置于20℃保存备用。引物RNase。仪器设备及耗材灭菌试管（0.5mL1.5mL）。微量移液器（量程：0.5µL～10µL、10µL～100µL、20µL～200µL、100µL～1000L）。生物安全柜。d）–20℃冰箱。e）f）LoopampLA-320c。g）冰（碎冰）及冰盒。h）无菌的密封袋。i）棉拭子。j）烧杯：100mLk）离心管：1.5mL、2.0mL。l）LAMP反应管：200µL。移液器吸嘴：1000µL、200µL、10µL等多种规格。一次性手套。o）采样试管（5、10mL）p）试管架。试剂DNA试剂盒用于粪便基因组DNA的提取试剂（商品化试剂盒产品）。Loopamp®扩增反应试剂盒Loopamp®扩增反应试剂（商品化试剂盒产品）。LAMP试剂如下：２×反应缓冲液［Tris-HCl（pH8.8）40mmol/L、KCl20mmol/L、MgSO416mmol/L、（NH4）2SO420mmol/L、吐温-20（Tween20）0.2%、乙酸三甲铵内盐6s8LtA、DNA。DNAHindλDNA后，取其片段（6.557bp）重组入质粒所得。阴性对照阴性对照使用灭菌去离子水。实验动物结肠小袋纤毛虫核酸检测方法实验动物结肠小袋纤毛虫核酸检测方法73样品采集、运输、处理样品采集、运输、处理和检测的生物安全要求有关生物安全和防止交叉污染的措施见附录B。样品采集2.0g～5.0标记样品编号、名称、采样时间、采集单位。样品的保存和运输724保存期不超过半个月。样品的预处理2.0g～5.0100mg～300mg2mLDNA提取或置于–20℃保存备用。操作程序DNA提取5.4100mg～300mg2mLDNA50µLDNAPCR管中进行后续反应或置于–20℃保存备用。LAMP样品反应体系配制LAMP样品反应体系2×反应缓冲液 12.5µLBstDNA聚合酶 1µLxmc-F3 5pmolxmc-B3 5pmolxmc-FIP 40pmolxmc-BIP 40pmol去离子水（DW） 补足23µL。分装后，放入微量离心机中离心数秒（瞬时离心），以此作为预混溶液，配制好的预7474中国实验动物学会团体标准汇编及实施指南（第六卷）混溶液立即使用。对照反应体系2×反应缓冲液 12.5µL引物溶液DNA 2.5µLBstDNA聚合酶 1µL去离子水（DW） 补足23µL。预混溶液与样本溶液混合添加样本溶液（DNA）2µL25µL，对照反应中，阴性2µLDNA2µL，合上盖子轻击使溶液充分混匀后瞬时离心。上机检测6360min855min。结果判定实时浊度仪实时监测反应扩增情况，仪器通过读取反应管的浊度值绘制浊度曲线，在阴阳性对照成立的情况下，样品反应管出现浊度上升曲线的为阳性结果，没有出现浊度上升曲线的为阴性结果（见附录A.5）。实验动物结肠小袋纤毛虫核酸检测方法实验动物结肠小袋纤毛虫核酸检测方法75附 录 A（规范性附录）特异性引物序列及检测结果图示结肠小袋纤毛虫引物扩增的目的基因目的基因：18SrRNA基因。结肠小袋纤毛虫外引物xmc-F3：AGAGTGTTTCAAGCAGGCxmc-B3：TCTTTGATCCCCTATCTTTCG结肠小袋纤毛虫内引物xmc-FIP：CAACTGTCCCTATTAATCGCAATCTTACATTAGCATGGAATAACGAATxmc-BIP：AATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTAATGAAAACATCCTTGGCARNase去离子水的配制0.1%15min，冷却备用。A.5LAMP检测结果图示A.5LAMP检测结果如图A.1所示。图A.1LAMP检测结果图7676中国实验动物学会团体标准汇编及实施指南（第六卷）附 录 B（规范性附录）操作规范检测过程中防止交叉污染的措施采样和制样过程采样和制样工具，应清洗干净，121℃，15min～20min灭菌，一套清洁工具仅限于一个样品使用。存放样品的容器应该经过清洗、灭菌，或为灭菌